苯并芘对孕早期小鼠胎盘绒毛组织的影响及芦丁的防护作用研究

高秀霞,刘　琨，陈　娟,侯海燕

(1. 武警后勤学院附属医院，天津 300162；2. 武警辽宁省总队大连医院，辽宁 大连 116000)



苯并芘对孕早期小鼠胎盘绒毛组织的影响及芦丁的防护作用研究

高秀霞1,刘琨2，陈娟1,侯海燕1

(1. 武警后勤学院附属医院，天津 300162；2. 武警辽宁省总队大连医院，辽宁 大连 116000)

[摘要]目的探讨苯并芘(BaP)对孕早期小鼠胎盘绒毛组织细胞的影响及芦丁的防护机制。方法选取性成熟ICR小鼠150只(雌鼠100只、雄鼠50只)，随机分为空白组，模型组及芦丁低、中、高剂量组，每组30只(雌鼠20只、雄鼠10只)，雌雄分开饲养。模型组予BaP 2 mg/(kg·d)灌胃；芦丁低、中、高剂量组予BaP 2 mg/(kg·d)的同时分别灌胃芦丁0.5，1，2 g/(kg·d)；空白组灌胃相同体积的0.9%氯化钠注射液与橄榄油。各组连续灌胃15 d后雌雄鼠同笼，第2天发现精液栓为受孕，挑出受孕小鼠继续灌胃7 d后处死，取胎盘组织测定bax与bcl-2 mRNA表达水平及细胞色素P450(CYP450)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果模型组bax mRNA表达水平及bax/bcl-2比值均明显高于空白组(P均<0.05)；芦丁各剂量组bax mRNA表达水平及bax/bcl-2比值均明显高于空白组(P均<0.05)，但均低于模型组(P均<0.05)，且随着芦丁剂量的增加二者逐渐降低(P均<0.05)。模型组bcl-2 mRNA表达水平明显低于空白组(P均<0.05)；芦丁各剂量组bcl-2 mRNA表达水平均低于空白组(P均<0.05)，但均高于模型组(P均<0.05)，且随着芦丁剂量的增加其表达水平逐渐升高(P均<0.05)。bax与bcl-2 mRNA表达水平间呈负相关性(r=-0.825，P=0.021)。芦丁各剂量组CYP450活性均明显高于空白组(P均<0.05)，但低于模型组(P均<0.05)，且随着芦丁剂量的增加其活性逐渐降低(P均<0.05)；芦丁各剂量组GSH-PX、SOD活性均明显低于空白组(P均<0.05)，但均高于模型组(P均<0.05)，且随着芦丁剂量的增加二者活性逐渐升高(P均<0.05)。结论芦丁能通过提高抗氧化酶活力与抑制凋亡基因表达来保护BaP所致的胎盘绒毛组织细胞损伤，提高生育能力。

[关键词]苯并芘；芦丁；胎盘绒毛组织；凋亡；妊娠

苯并芘(BaP)是多环芳烃类化合物(PAHs)中的代表，形成于能源物质与肉类食物的不完全燃烧，其能导致细胞发生凋亡，其致凋亡机制是通过肝脏代谢过程中经细胞色素P450酶(CYP450)作用而产生大量氧化性极强的中间产物二氢二醇环氧苯并芘(BPDE)与大量的氧自由基[1]。胎盘是母体与胚胎进行物质交换的场所，其功能降低后会影响胚胎发育。Detmar等[2]通过大鼠暴露于低浓度的BaP研究显示，BaP诱发凋亡是通过增加胎盘与胎膜内皮细胞上的凋亡相关基因的表达来实现的。其致凋亡具体路径是其与DNA形成加合物后作用于芳香烃受体(AhR)，进一步活化bax基因而发挥作用[3]。芦丁(RU)是黄酮类化合物中的代表物质，微溶于水，易溶于热乙醇、乙醚等有机溶剂，是黄酮类化合物中抗氧化能力最强的，长期服用有调节血脂、血糖及其抗肿瘤等功效[4]。为明确芦丁能否抑制BaP所诱导的胎盘绒毛组织凋亡及其保护作用机制，笔者进行了相关研究，现将结果报道如下。

1实验资料

1.1实验动物及分组选取性成熟ICR小鼠150只(雌鼠100只、雄鼠50只)，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，周龄6～8周，体质量30～34 g，动物合格证号SCXK-(京)2012-0002。用随机数字法分为空白组、模型组及芦丁低、中、高剂量组，每组30只(雌鼠20只、雄鼠10只)。

1.2实验方法雌、雄鼠分开饲养，饲养温度控制在20～26 ℃，12 h光照，12 h黑暗，颗粒饲料喂养(雌鼠给予高蛋白饲料)，自由饮水饮食。模型组雌鼠予BaP(美国Sigma公司产品) 2 mg/(kg·d)灌胃；芦丁低、中、高剂量组雌鼠予BaP 2 mg/(kg·d)的同时分别灌胃芦丁(美国Sigma公司产品)0.5，1，2 g/(kg·d)；空白组雌鼠灌胃相同体积的0.9%氯化钠注射液与橄榄油(西班牙品利公司产品)。BaP用橄榄油配成混悬液，芦丁用生理盐水配成混悬液，两种制剂均配好后避光4 ℃保存，现用现配。连续灌胃15 d后雌雄鼠同笼，第2天发现有精液栓为怀孕第1天[5]，将已受孕的小鼠按上述方法再连续灌胃7 d(ICR小鼠孕周期为20 d，早孕为7 d[5])，最后一次灌胃后颈椎脱臼法处死小鼠并立即放于冰台(-4～0 ℃)上，无菌条件下取出胎盘组织，检测相关指标。

1.3bax与bcl-2 mRNA表达水平测定采用RT-PCR法测定。称取10 mg新鲜胎盘组织并按Trizol试剂盒(美国Invitrogen公司产品)说明书提取出总RNA。以下步骤试剂盒为日本TaKaRa公司产品，RNA纯度与完整性符合要求后按试剂盒说明以(oligo) dT为引物逆转录合成cDNA第一链，以2 μL的cDNA为模板按试剂盒说明进行PCR扩增，GAPDH为内参照。反应条件：94 ℃ 60 s、Tm(根据不同的退火温度定)50 s、72 ℃下90 s，连续进行40个循环。扩增产物在琼脂糖凝胶(20 g/L)电泳槽中跑40 min，取出凝胶并在紫外灯(260 nm)下进行照相。用quantity one软件对照片中各个目的基因的条带密度与宽度进行分析，以管家基因GAPDH为内参照计算各个样本的基因条带密度的相对值，Marker由小到大依次是100，250，500，750，1 000，2 000 bp，引物由日本TaKaRa公司合成，聚丙烯酰胺凝胶电泳采用PCGE级纯化，基因序列如下：bax引物(335 bp、Tm 59 ℃)上游：5’-CCGGCGAATTGGAGATGAACTG-3’,下游：5’-TGGTCACTGTCTGCCATGTGGG-3’；bcl-2引物(741 bp、Tm 56 ℃)上游：5’-CGGAGGAAGTAGACTGATATTAACAAAG-3’,下游：5’- CCGAACTCAAAGAAGGCCACA-3’；GAPDH引物(239 bp、Tm：52 ℃)上游：5’-ATTGTCAGCAATGCATCCTG-3’,下游：5’-TTCAGCTCTGGGATGACCTTGCC-3’。

1.4CYP450酶活性检测[6]试剂盒为德国Promegen公司产品。将取出的新鲜胎盘组织用0 ℃ 0.9% NaCl冲洗直至为清亮液体流下为止，每克胎盘组织加0.2 mmol/L的PBS溶液(pH=7.4)5.0 mL，在0～4 ℃下10 000～15 000 r/min离心15 min，取上清液，再用超速低温离心机(美国Beckman公司产品)100 000 r/min离心60 min，抽取上清液，保留沉淀，继续加入0.2 mmol/L PBS缓冲液(pH=7.4)，每克组织所得微粒体沉淀物加缓冲液1.0 mL后混匀。将10 mg/mL的微粒体蛋白混悬液0.3 mL加入5.7 mL的PBS混悬液(pH=7.4)后充分混匀，分装在2只比色杯中，置于UA-265双光道双光束紫外分光光度计(日本岛津公司产品)中并在400～500 nm基线间进行扫描。取数毫克连二亚硫酸钠保险粉加入两比色杯中并混匀，将CO轻轻充入样品杯中并扫描400～500 nm的差异光谱，以450 nm和490 nm处吸光度值为基础计算出CYP450酶活性。

1.5GSH-PX、SOD酶活性检测将取出的新鲜胎盘组织在4 ℃下10 000～15 000 r/min匀浆(匀浆时间10 s/次，间隙30 s，连续3～4次)，按试剂盒(南京建成生物技术公司产品)说明称取组织后先测定蛋白含量(双缩脲法)，再按试剂盒说明，采用BioPhotometer型生物分光光度计(德国Eppendorf公司产品)测定并按照公式计算出GSH-PX、SOD活性值。

1.6胎盘绒毛组织细胞观察将取出的新鲜胎盘组织用0.9% NaCl溶液冲洗干净后浸泡于10%多聚甲醛(美国Sigma公司)中，石蜡包埋后制成石蜡切片，将石蜡块按5 μm的厚度切片附于经多聚赖氨酸附膜的载玻片上，每隔10张切片染色1张。将切片在40 ℃水中展平，平铺于载玻片上。将载玻片放入60 ℃烤箱中烤片，按照试剂盒(天津灏洋生物制品科技公司)说明进行染色，封片后在显微镜下观察，进行400×的显微照相。

2结果

2.1各组受孕情况模型组成功受孕9只(45%)，芦丁低剂量组成功受孕8只(40%)，芦丁中剂量组成功受孕10只(50%)，芦丁高剂量组成功受孕11只(55%)，空白组成功受孕10只(50%)。

2.2各组小鼠胎盘绒毛组织中bax、bcl-2 mRNA表达水平比较模型组bax mRNA表达水平及bax/bcl-2比值均明显高于空白组(P均<0.05)；芦丁各剂量组bax mRNA表达水平及bax/bcl-2比值均明显高于空白组(P均<0.05)，但均低于模型组(P均<0.05)，且随着芦丁剂量的增加二者逐渐降低(P均<0.05)。模型组胎盘绒毛组织中bcl-2 mRNA表达水平明显低于空白组(P均<0.05)；芦丁各剂量组bcl-2 mRNA表达水平均低于空白组(P均<0.05)，但均高于模型组(P均<0.05)，且随着芦丁剂量的增加其表达水平逐渐升高(P均<0.05)。bax和bcl-2 mRNA表达水平间呈负相关性(r=-0.825，P=0.021)。见表1。

表1　各组小鼠胎盘绒毛组织中bax、bcl-2 mRNA

注:①与模型组比较，P<0.05；②与芦丁低剂量组比较，P<0.05；③与芦丁中剂量组比较，P<0.05；④与芦丁高剂量组比较，P<0.05。

2.3各组小鼠胎盘绒毛组织中CYP450、GSH-PX、SOD活性比较芦丁各剂量组CYP45活性均明显高于空白组(P均<0.05)，但均低于模型组(P均<0.05)，且随着芦丁剂量的增加其活性逐渐降低(P均<0.05)；芦丁各剂量组GSH-PX、SOD活性均明显低于空白组(P均<0.05)，但均高于模型组(P均<0.05)，且随着芦丁剂量的增加二者活性逐渐升高(P均<0.05)。见表2。

2.4各组小鼠胎盘绒毛组织细胞凋亡情况HE染色400倍光镜下观察发现，模型组中可见细胞排列紊乱，部分细胞形态异常，细胞呈空泡状，或胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，其数量明显高于其他4组，见图1；芦丁低剂量组表现与模型组近似，但核固缩、破裂细胞较模型组减少，见图2；芦丁中、高剂量组细胞排列较以上2组整齐，核固缩、核碎裂、核溶解、细胞膜皱缩、破裂的细胞较少，见图3及图4；空白组细胞排列有序，细胞形态多数正常，异常细胞数量较少，见图5。

表2　各组小鼠胎盘绒毛组织中CYP450、

注:①与模型组比较，P<0.05；②与芦丁低剂量组比较，P<0.05；③与芦丁中剂量组比较，P<0.05；④与芦丁高剂量组比较，P<0.05。

图1　模型组胎盘绒毛组织细胞凋亡情况(HE，400×)

图2　芦丁低剂量组胎盘绒毛组织细胞凋亡情况(HE，400×)

图3　芦丁中剂量组胎盘绒毛组织细胞凋亡情况(HE，400×)

3讨论

芦丁主要来源于姜科植物山奈的根茎，有些水果、蔬菜中也含有山奈酚，目前很多实验室已从茶叶、蜂胶、柚子等植物中提取到它的纯品，其有一定的抑癌功效[7]。黄酮类物质除了有较强的抗氧化能力外，还能降低BaP所诱导的CYP450活性增强(这是其他抗氧化剂所没有的)，从而降低代谢产物BPDE的产生，减轻氧化损伤[8]，因此可选择芦丁对抗BaP氧化损伤。

图4　芦丁高剂量组胎盘绒毛组织细胞凋亡情况(HE，400×)

图5　空白组胎盘绒毛组织细胞凋亡情况(HE，400×)

bax基因本身发挥凋亡作用必须与bcl-2基因配合才能完成，当bax形成同源二聚体时发挥促进凋亡作用，而bcl-2基因表达量升高，与bcl-2基因结合形成异源二聚体时发挥抑制凋亡作用[9]。本实验结果显示，模型组bax mRNA表达水平及bax/bcl-2比值均明显高于空白组；芦丁各剂量组bax mRNA表达水平及bax/bcl-2比值均明显高于空白组，但均低于模型组，且随着芦丁剂量的增加二者逐渐降低。模型组胎盘绒毛组织中bcl-2 mRNA表达水平明显低于空白组；芦丁各剂量组bcl-2 mRNA表达水平均低于空白组，但均高于模型组，且随着芦丁剂量的增加其表达水平逐渐升高。bax和bcl-2 mRNA表达水平间呈负相关性。模型组发生细胞核固缩与溶解、细胞形态异常的细胞明显高于其他组，而芦丁各剂量组有所减少。提示BaP能通过升高胎盘绒毛组织bax mRNA表达量与降低bcl-2 mRNA表达量而诱导胎盘绒毛组织细胞发生凋亡；BaP可使bax/bcl-2比值升高，而芦丁可通过降低bax mRNA表达量并升高bcl-2 mRNA表达量而抑制细胞凋亡，且芦丁2 g/(kg·d)抑制效果最强。

CYP450是一个大家族，其家族成员目前已知有14个，人体内有30个同工酶，主要分布于肝脏，参与药物与毒物的代谢，一般发挥解毒效应，但在有些条件下代谢产物毒性较强，在代谢BaP过程中就主要发挥增毒效应。BaP在肝脏中的CYP450作用过程中产生大量活性氧物质造成过氧化损伤，该酶活性强弱在染毒早期反映其染毒程度强弱，染毒程度越高活性越强，而晚期该酶耗尽，活力降低[10]。朱淑萍等[11]通过妊娠早期大鼠BaP灌胃致畸胎动物模型证实大鼠孕早期经BaP毒染能使胎盘绒毛组织中CYP450活性升高，而晚期活性降低。本研究结果显示，芦丁各剂量组CYP45活性均明显高于空白组，但均低于模型组，且随着芦丁剂量的增加其活性逐渐降低，与上述结论一致。

BaP经CYP450代谢可以产生大量活性氧，机体需要启动抗氧化防御体系来保护机体免受其损害。SOD 和GSH-PX是主要的抗氧化酶，SOD 主要促使过氧化物游离基转化成过氧化氢和氧，从而清除炎症过程中伴随产生的过氧化物游离基；GSH-PX可催化脂质过氧化物(LPO)分解生成相应的醇,防止LPO均裂和引发脂质过氧化作用的链式支链反应,减少LPO的生成以保护机体免受损害[8，12]。本研究结果显示芦丁各剂量组GSH-PX、SOD活性均明显低于空白组，但均高于模型组，且随着芦丁剂量的增加二者活性逐渐升高。

综上所述，芦丁能升高胎盘绒毛组织抗氧化酶活性并且降低CYP450活性，纠正氧化与抗氧化失衡，并能通过降低bax mRNA表达水平和升高bcl-2 mRNA表达水平来抑制凋亡。但本研究仅针对妊娠期间胚胎对外界环境污染物最为敏感的早期进行了研究，对孕中期及晚期还未研究，且芦丁是否能像维生素E一样应用于妊娠前期与妊娠期妇女的日常保健而预防不良妊娠结局的发生，均值得进一步研究。

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Effort of BaP on placental villus tissue in the early pregnancy mice and study on the protection of Rutin

GAO Xiuxia1, LIU Kun2, CHEN Juan1, HOU Haiyan1

(1.Affiliated Hospital of Armed Police Logistics Institute, Tianjin 300162, China; 2.Dalian Hospital of PAP Corps of Liaoning Province, Dalian 116000, Liaoning, China)

Abstract:Objective It is to explore the effort of BaP on cells of placental villus tissue in the early pregnancy mice and to study the protection mechanism of Rutin.Methods 150 viripotent ICR mice(100 male mice, 50 female mice) were randomly divided into five groups: blank group, model group, low, middle and high dose of BaP groups, every group had 30 mice(20 male mice,10 female mice), all the female and male mice were separated and raised respectively. The mice in model group was lavaged with BaP 2 mg/(kg·d), the ones in ow, middle and high dose of BaP groups were lavaged with BaP 2 mg/(kg·d) and Rutin [0.5,1.0,2.0 g/(kg·d)] respectively, blank group was lavaged with normal saline(0.9%)+olive oil. After treating for 15days, male mice were mated with female mice, on the second day, gestational age was determined based on the presence of a vaginal plug, continued lavaging for 7 days.The mice were euthanized to detect the gene of bax and bcl-2 in the level of mRNA and the activity of cytochrome 450,GSH-PX and SOD in placental villus. Results The expression level of bax mRNA and bax/bcl-2 in model group were higher than that in blank group (P<0.05), the expression level and ratio in every Rutin group were higher than that in blank group, but lower than that in model group (P all<0.05), and with the dose increasing the decreasing was more significant (P<0.05). The expression level of bcl-2 mRNA in model group were lower than that in blank group (P<0.05), the expression level in every Rutin group was lower than that in blank group, but higher than that in model group (P all<0.05), and with the dose increasing the increasing was more significant (P<0.05). The expression of bax and bcl-2 mRNA were negatively related (r=-0.825,P=0.021). The activity of cytochrome P450 in every Rutin group was higher than that in blank group, but lower than that in model group (P<0.05), with the dose increasing, its activity decreased gradually (P<0.05), The activity of GSH-PX, SOD in every Rutin group was lower than that in blank group, but higher than that in model group (P<0.05), with the dose increasing, their activity increased gradually (P<0.05). Conclusion Rutin can protect cell injury in placental villus tissue induced by BaP and improve fertility by increasing activity of antioxidant enzyme and inhibiting expression of apoptotic genes.

Key words:BaP; Rutin; placental villus; apotosis; pregnancy

[收稿日期]2015-08-10

[中图分类号]R-332

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)02-0122-05

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.02.003

[基金项目]天津市应用基础与前沿技术研究计划项目(15JCQNJC 2300)

[作者简介]高秀霞，女，博士研究生在读，主治医师，主要从事妇科内分泌及不孕症诊治工作。