黄连温胆汤对2型糖尿病大鼠肝损伤的保护作用

刘　舟，李月碧，张卫华，刘华东，马世平

(1. 南京中医药大学，江苏 南京 210023；2. 中国药科大学，江苏 南京 211198)



黄连温胆汤对2型糖尿病大鼠肝损伤的保护作用

刘舟1，李月碧2，张卫华1，刘华东1，马世平2

(1. 南京中医药大学，江苏 南京 210023；2. 中国药科大学，江苏 南京 211198)

[摘要]目的观察黄连温胆汤对2型糖尿病大鼠肝损伤的保护作用。方法取10只健康雄性SD大鼠作为空白组，给予常规饲料喂养；另取健康雄性SD大鼠60只采用50 d高糖高脂饲料喂养合并一次性链脲佐霉素(STZ)35 mg/kg腹腔注射方法构建2型糖尿病大鼠模型。将50只造模成功大鼠随机分为模型组,二甲双胍组及黄连温胆汤低、中、高剂量组，每组10只。二甲双胍组给予二甲双胍0.2 g/kg灌胃，黄连温胆汤低、中、高剂量组分别给予黄连温胆汤3，6，12 g/kg灌胃，模型组和空白组灌胃等体积生理盐水，均连续灌胃30 d。末次灌胃后测定大鼠饮食量、饮水量、尿量，取血检测血清谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)，之后处死大鼠镜下观察肝脏组织表现，计算肝质量指数。结果模型组大鼠的食量、饮水量和尿量均明显高于空白组(P均<0.05)；各给药组大鼠的饮水量和尿量均明显低于模型组(P均<0.05)，各给药组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；各给药组大鼠的饮食量与模型组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。模型组大鼠肝质量指数及血清AST、ALT水平均明显高于空白组(P均<0.05)；各给药组大鼠肝质量指数及血清AST、ALT水平均明显低于模型组(P均<0.05)。镜下观察各给药组大鼠肝脏组织中细胞空泡和炎症细胞浸润均明显减少。结论黄连温胆汤能抑制糖尿病大鼠的肝肿大和炎症反应，降低血清AST和ALT水平及肝质量指数，保护肝细胞。

[关键词]糖尿病； 肝损伤； 黄连温胆汤

随着人们生活水平的提升，糖尿病的发病率越来越高。糖尿病以代谢紊乱和高血糖为主要特征，可引起全身多脏器的病变。肝脏是糖代谢的主要器官，长期的高血糖对肝脏的损害十分严重，但因其代偿能力较强，早期的肝损伤并不明显，但到后期肝损伤发展到一定程度后将无法逆转。文献报道糖尿病肝病的发生率为10%～30%[1]，且糖尿病患者死亡多因肝细胞损伤所引起[2]。肝脏是糖脂代谢的关键部位，糖尿病中出现的高血糖和脂质堆积超出了肝脏的清除能力，造成肝脏损害，而肝脏损害之后糖脂代谢的调节能力进一步下降，最终形成恶性循环，使得病变更加严重[3]。目前治疗糖尿病的口服化学性降糖药都有一定的不良反应，且对肝脏有损伤作用，因此使得糖尿病肝损伤的治疗难度加大。中医认为热毒、瘀毒、痰毒、湿毒是糖尿病肝损伤的病因，因此可以通过清热、活血、祛痰、化湿、解毒等方法治疗糖尿病肝损伤[4]。黄连温胆汤是中医名方，首见于清朝陆廷珍的《六因条辨》，其主要功效是清热燥湿、理气化痰。临床研究发现黄连温胆汤对糖尿病[5]及其并发症[6]、代谢综合征[7]有很好的治疗作用，但对糖尿病引起的肝损伤的影响尚少见报道，故本研究通过大鼠实验观察了黄连温胆汤对2型糖尿病引起的肝损伤的保护作用，现将结果报道如下。

1实验资料

1.1药材与试剂黄连、竹茹、半夏、陈皮、枳实、茯苓、甘草、生姜均购自先声再康药店。谷草转氨酶(AST，批号：20131102)、谷丙转氨酶(ALT，批号：20141102)测试试剂盒购自南京建成生物有限公司。链脲佐霉素(STZ)购自Sigma公司，用柠檬酸柠檬酸钠缓冲液(pH=4.4)配制成10 mg/mL的溶液，避光保存，现配现用。磷酸盐缓冲液(PBS)由8.0 g NaCl+0.20 g KCl+1.44 g Na2HPO4+0.24 g KH2PO4溶于800 mL双蒸水中，用HCl调节pH至7.4，加水至1 L。

1.2仪器酶标仪(Thermo，美国)，低温离心机(Kubota，日本)，HH-4数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)，电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)等。

1.3动物清洁级雄性SD大鼠70只，购自江苏大学实验动物中心，许可证号：SCXK(苏)2009-0002，体质量180～200 g。动物分笼饲养，12 h昼夜节律，室温22～24 ℃，自由饮食饮水。

1.4方法

1.4.1药材处理黄连温胆汤中各药物的比例按照清代陆皮∶茯苓∶甘草∶生姜=4∶4∶4∶4∶6∶3∶2∶2)。将饮片浸泡30 min，水煎煮2次，每次煎30 min，用纱布趁热滤过，60 ℃恒温水浴浓缩至1.2 g/mL，冷藏备用。

1.4.2动物分组与2型糖尿病模型的建立取10只健康雄性SD大鼠作为空白组，给予常规饲料喂养；其余60只大鼠均用高糖高脂饲料(10%猪油、15%蔗糖、5%蛋黄粉、0.5%胆固醇、0.5%胆酸盐、69%常规饲料)喂养50 d后，一次性腹腔注射STZ 35 mg/kg。1周后测定大鼠血糖，血糖值>13.9 mmol/L证实造模成功。将50只造模成功大鼠随机分为模型组、二甲双胍组及黄连温胆汤低、中、高剂量组，每组10只。二甲双胍组给予二甲双胍0.2 g/kg 灌胃，黄连温胆汤低、中、高剂量组分别给予黄连温胆汤3，6，12 g/kg(生药材量)灌胃，模型组和空白组灌胃等体积生理盐水。每日9：00—11：00灌胃给药，连续给药30 d。

1.4.3食量、饮水量和尿量的测定末次灌胃后，将大鼠分别放入代谢笼中测定大鼠24 h内食量、饮水量和尿量。

1.4.4血清谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)水平的测定各组大鼠眼眶取血2 mL，静置后3 500 r/min 4 ℃离心10 min，吸取上层血清，按照试剂盒说明书测定血清AST、ALT水平。

1.4.5肝脏组织病理观察每组取3只大鼠麻醉后，固定在实验台上，剪开胸腔，从心尖插入针，剪开右心耳，向心室内灌注150 mL PBS和100 mL 4%多聚甲醛后取出肝脏，放入10%福尔马林溶液中固定。使用冰冻切片机将肝脏切成4 μm的切片，用石蜡包埋好。根据说明书脱水、透明再进行肝脏HE染色，封片后在光学显微镜400倍视野下观察组织病变情况。

1.4.6肝质量指数每组剩余大鼠处死后完整取出大鼠肝脏称质量，计算肝质量指数=肝质量/体质量×100%。

2结果

2.1各组大鼠基础代谢情况比较模型组大鼠的食量、饮水量和尿量均明显高于空白组(P均<0.05)；各给药组大鼠的饮水量和尿量均明显低于模型组(P均<0.05)，各给药组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；各给药组大鼠的饮食量与模型组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1　各组大鼠食量、饮水量和尿量比较±s)

注：①与空白组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

2.2各组肝质量指数和血清AST、ALT水平比较模型组大鼠肝质量指数及血清AST、ALT水平均明显高于空白组(P均<0.05)。各给药组大鼠肝质量指数及血清AST、ALT水平均明显低于模型组(P均<0.05)，各给药组间血清AST水平比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；黄连温胆汤高剂量组ALT水平明显低于黄连温胆汤低剂量组(P<0.05)，而与二甲双胍组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2　各组肝质量指数和血清AST、ALT水平比较±s)

注：①与空白组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05；③与黄连温胆汤低剂量组比较，P<0.05。

2.3各组大鼠肝脏病理表现光学显微镜下发现空白组肝细胞排列整齐，核圆、大，居中，无炎症细胞浸润；模型组与空白组相比出现了明显的细胞皱缩，细胞核被挤到一边，细胞间空泡增多增大，炎症细胞浸润增多；而各给药组细胞空泡和炎症细胞浸润均明显减少。见图1～6。

图1　空白组肝脏组织镜下表现(HE，400×)

图2　模型组肝脏组织镜下表现(HE，400×)

图3　二甲双胍组肝脏组织镜下表现(HE，400×)

图4　黄连温胆汤低剂量组肝脏组织镜下表现(HE，400×)

图5　黄连温胆汤中剂量组肝脏组织镜下表现(HE，400×)

图6　黄连温胆汤高剂量组肝脏组织镜下表现(HE，400×)

3讨论

糖尿病是继心血管疾病和肿瘤后的第三大威胁人类健康的非传染性疾病[8]，其中90%为2型糖尿病。2型糖尿病的主要特征是胰岛素抵抗造成的糖脂紊乱，而肝脏作为糖脂代谢的关键器官，受到的损伤最为严重，临床主要表现为肝肿大、脂肪肝、肝纤维化、肝硬化等。肝脏是糖原储存的主要器官，机体各部分的能量供应都是依赖于肝糖原分解成葡萄糖通过血液输送至各组织细胞的。胰岛素的分泌不足使得肝脏中的糖原难以被分解利用，因此长期的高血糖状态引起肝脏内糖原过多蓄积，使得肝细胞肿胀，代谢紊乱,最终引起肝脏组织损伤[9]。另一方面，糖尿病患者对糖的利用障碍导致脂肪组织大量动员，外周组织中脂肪分解增多，引起血液中游离脂肪酸增高，通过门静脉系统进入肝脏，引起肝细胞中过度的脂质堆积，也会损伤肝脏[10]。AST和ALT是临床肝功能检查的指标，主要位于肝细胞内，肝脏损伤后会引起细胞内ALT和AST渗漏进入血液，结果使血清中 ALT 及 AST 含量升高。此外，肝细胞的破坏能引起炎性反应，会使得组织外液内流导致肝脏肿大。

黄连温胆汤由二陈汤衍化而来，方中黄连清热燥湿，竹茹清热化痰，半夏、陈皮配伍燥湿化痰，茯苓健脾渗湿，枳实行气破滞，生姜和胃，甘草调和诸药，诸药合用共奏清热化痰行气之功。本研究通过长期高脂饲料喂养合并小剂量STZ腹腔注射建立2型糖尿病大鼠模型，结果显示，模型组大鼠的食量、饮水量和尿量均明显高于空白组；各给药组大鼠的饮水量和尿量均明显低于模型组，各给药组间比较差异无统计学意义；各给药组大鼠的饮食量与模型组比较差异无统计学意义，推测可能受到了其他因素的调控。模型组大鼠肝质量指数及血清AST、ALT水平均明显高于空白组；各给药组大鼠肝质量指数及血清AST、ALT水平均明显低于模型组。镜下观察各给药组大鼠肝脏组织中细胞空泡和炎症细胞浸润均明显减少。表明黄连温胆汤对2型糖尿病大鼠引起的肝损伤有较好的逆转作用。

综上所述，黄连温胆汤能抑制糖尿病大鼠的肝肿大和炎症反应，降低血清AST和ALT水平及肝质量指数，保护肝细胞。但其作用机制还需要进一步研究。

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Protective effect of Huanglian Wendan decoction on liver damage in rat model of type 2 diabetic mellitus

LIU Zhou1, LI Yuebi2, ZHANG Weihua1, LIU Huadong1, MA Shiping2

(1. Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210023, Jiangsu, China; 2. China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, Jiangsu, China)

Abstract:Objective It is to observe the protective effect of Huanglian Wendan decoction on liver damage in rat model of type 2 diabetic mellitus. Methods 10 healthy male SD rats were selected as blank group and were fed with normal fodder, another 60 rats were given 50 days high-glucose-high-fat diet and 35 mg/kg streptozocin (STZ) injection once to establish rat models of type 2 diabetic mellitus. 50 successful rat models were divided into model group treated with normal saline, metformin group treated with metformin (0.2 g/kg), and low, middle and high dose of Huanglian Wendan decoction groups treated with Huanglianwendan decoction (3, 6, 12 g/kg respectively), all the rats were treated by gavage for 30 days. After the end of gabage, the consumption of food, water and urinary volume were recorded and serum AST and ALT were determined, then the rats were killed to observe liver tissue changes under light microscope and calculate liver weight index. Results The consumption of food, water and urinary volume of the rats in model group were more than that in blank group (P all<0.05); the quality of water drink and urinary volume in every treatment group were less than that in model group (P all<0.05), there was no significant difference among every treatment group (P all>0.05). The difference in quality of food consumption was not significant between model group and other treatment groups (P all>0.05). Liver index and serum levels of AST and ALT in model group were higher than that in blank group (P all<0.05), but these indicators in every treatment group were lower than that in model group (P all<0.05). Light microscope showed than cell vacuolation and inflammatory cell invasion decreased obviously in every treatment group. Conclusion Huanglian Wendan decoction can inhibit hepatomegaly and inflammatory reaction in the rats with type 2 diabetic mellitus, decrease the levels of serum AST and ALT and liver weight index, protect liver cells.

Key words:diabetes; liver damage; Huanglian Wendan decoction

[收稿日期]2015-09-15

[中图分类号]R-332

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)02-0119-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.02.002

[基金项目]教育部博士点基金项目(20113237120007)；江苏省高校自然科学研究计划项目(12KJD360002)；江苏省中医药局科技项目(LZ13001)；南京中医药大学国家基金预研项目(12XYY03)

[作者简介]刘舟，女，博士，讲师，从事中医藏象与病因病机的研究。[通信作者]张卫华，E-mail：zwhtcm@163.com