自拟更年汤对肾阳虚型围绝经期模型大鼠雌激素样作用的研究

张　帆，易华娅，齐帅英，武创新，方　丽，杨玉涛

(1. 贵阳中医学院第二附属医院，贵州 贵阳 550002；2. 贵阳中医学院，贵州 贵阳 550002)



论著

自拟更年汤对肾阳虚型围绝经期模型大鼠雌激素样作用的研究

张帆1，易华娅2，齐帅英2，武创新2，方丽2，杨玉涛1

(1. 贵阳中医学院第二附属医院，贵州 贵阳 550002；2. 贵阳中医学院，贵州 贵阳 550002)

[摘要]目的探讨自拟更年汤对肾阳虚型围绝经期模型大鼠的雌激素样作用机制。方法选择阴道细胞学表现为有规律的4～5 d动情周期的4月龄雌性SD大鼠20只为青年组，阴道细胞学表现无动情周期改变的18月龄雌性SD大鼠20只为老年组；选用自然老化的围绝经期雌性SD大鼠，肌注氢化可的松构建肾阳虚型围绝经期大鼠模型，将造模成功大鼠随机分为更年汤组、教材方组、利维爱组和生理盐水组。青年组、老年组、生理盐水组均给予生理盐水灌胃，各给药组给予相应药物灌胃，灌胃15 d后处死大鼠，分离摘取子宫称子宫湿质量，计算子宫指数，采用免疫组化及原位杂交检测方法观察大鼠子宫组织中血管内皮生长因子(VEGF)及其信使VEGF mRNA的阳性表达情况。结果各给药组子宫湿质量、子宫指数均明显高于生理盐水组和老年组(P均<0.05)；更年汤组子宫湿质量、子宫指数与青年组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，与利维爱组、教材方组比较差异均有统计学意义(P均<0.05)；利维爱组子宫湿质量、子宫指数与教材方组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。老年组和生理盐水组VEGF及VEGF mRNA阳性表达明显低于青年组(P均<0.05)。各给药组VEGF及VEGF mRNA的阳性表达明显高于生理盐水组、老年组(P均<0.05)，更年汤组、利维爱组VEGF及VEGF mRNA阳性表达明显高于教材方组(P均<0.05)，利维爱组VEGF及VEGF mRNA阳性表达与更年汤组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论自拟更年汤可促进子宫增生质量，具有雌激素样作用；其促进子宫增加质量的机制可能与上调子宫组织中VEGF及VEGFmRNA的阳性表达有关。

[关键词]自拟更年汤；肾阳虚；围绝经期；大鼠；血管内皮生长因子

植物雌激素是从天然植物中提取的结构与内源性雌激素相似的一类化合物，能够与雌激素受体(ERs)结合发挥生物学效应。近年的研究发现，植物雌激素具有多种生理活性，特别对妇女绝经后因雌激素减少引起的骨质疏松症、绝经综合征、心血管疾病以及激素依赖性肿瘤等有较好的预防和治疗作用[1]。中药复方为中医治病用药的最主要形式之一，其中具有植物雌激素样作用的中药复方在绝经期综合征的预防和治疗中发挥着重要作用。本实验通过观察自拟更年汤对肾阳虚型围绝经期模型大鼠子宫质量、子宫组织中血管内皮生长因子(VEGF)及其信使VEGF mRNA的阳性表达情况的影响，探讨自拟更年汤的雌激素样作用及其机制，旨在为其临床运用提供实验依据。

1实验资料

1.1实验药品自拟更年汤由熟地12 g、怀山药12 g、枣皮12 g 、仙茅12 g、仙灵脾12 g、巴戟天12 g、女贞子12 g、旱莲草12 g、桑寄生12 g、当归10 g、 桂枝9 g、独活9 g、防风9 g、细辛3 g、炙甘草6 g组成。教材方[2]由熟地、仙茅、仙灵脾各15 g，山药、杜仲、枣皮、菟丝子、知母各12 g，黄柏、当归各10 g，肉桂、甘草各6 g组成。更年汤及教材方的中药饮片均由北京同仁堂大药房(贵阳市大南门店)提供，并经中药饮片检验，于贵阳中医学院中心实验室用电磁炉煎熬，熬制好的药液在中心实验室4 ℃冰箱保存备用。生理盐水：250 mL/2.25 g，贵州省科伦药业有限公司生产，国药准字H20033939。注射用氢化可的松:50 mg/10 mL，湖北人民制药有限公司，国药准字H20058653。替勃龙片(利维爱)：2.5 mg×7片/盒，南京欧加农制药有限公司生产，国药准字H20051085。

1.2主要实验试剂BA0407 VEGF免疫组化染色试剂盒和VEGFmRNA(ISH-5173)原位杂交检测试剂盒由贵州爱瑞达生物科技有限公司提供。

1.3造模方法与分组应用阴道脱落细胞动情周期观察法对80只体质量280～300 g的11～12个月龄SD大鼠进行连续15 d观察筛选，结果所有大鼠底层细胞均在50%以上，涂片呈现为动情周期紊乱、动情间期延长,证明其属于围绝经期。将符合围绝经期模型的大鼠，每天常规消毒后左右交替于臀部肌肉丰厚的部位注射氢化可的松0.5 mL/100 g，连续肌注9 d，间停4 d。见动物出现持续性萎靡不振、反应迟钝、扎堆、拱背少动、毛不光洁、竖毛时则认为肾阳虚型模型造模成功。将造模成功的肾阳虚型大鼠随机分为更年汤组、教材方组、利维爱组、生理盐水组，每组20只。另选择阴道细胞学表现为有规律的4～5 d动情周期的4个月龄SD大鼠20只(体质量180～200 g)为青年组，阴道细胞学表现无动情周期改变的18月龄大鼠20只(体质量420～450 g)为老年组。以上动物均由重庆市中药研究院动物室提供[许可证号：scxk(渝)2012-0003]，微生物控制等级为Ⅰ级。

1.4给药方法及剂量每日9:30—11:30由专人选用5 mL无菌注射器抽取药液或生理盐水对各组大鼠灌胃，连续15 d。各给药组给药剂量均按人鼠体质量换算，人体质量按60 kg计算，人与大鼠的等效剂量比值为1∶(6～7)，剂量单位为mg/kg。更年汤组、教材方组、利维爱组分别给予更年汤溶液[含生药量1.8 g/mL,约18 g/(kg·d)]、教材方溶液[含生药量1.6 g/mL,约16 g/(kg·d)]、予利维爱溶液[含药量0.029 4 mg/mL,约0.294 mg/(kg·d)]各4 mL灌胃，青年组、老年组、生理盐水组均给予生理盐水4 mL灌胃。

1.5标本的采集与处理在实验过程中由于动物之间的相互撕咬等原因导致动物死亡，至采集标本时，大鼠的数量为青年组13只、老年组13只、生理盐水组13只、更年汤组16只、教材方组15只、利维爱组14只。于末次给药24 h后，将各组大鼠进行股动脉放血处死，剖取出大鼠子宫，去除其周围多余组织，放于电子天平上称取湿质量后放至标记好的盛有10%福尔马林溶液中固定。

1.6指标检测将已固定好的子宫组织送至贵阳医学院附属医院病理科进行检测，该科医生运用免疫组化及原位杂交方法观察子宫组织中VEGF及VEGF mRNA的阳性表达情况，实验方法严格参照试剂盒说明操作。根据子宫湿质量计算子宫指数，子宫指数=子宫湿质量/体质量×100%。

1.7免疫组化及原位杂交结果判定标准[3]按阳性细胞所占百分比及染色强度两者结合分析判断。阳性细胞所占百分比，即阳性细胞数≤25%为(+)，25%～50%为(),>50%为()，无阳性细胞(-)；染色强度：浅黄色为(+)，棕黄色()，棕褐色为()，未着色细胞为(-)。为了统计方便予以半定量计分：(-)为0分，(+)为1分，()为2分，()为3分。每张切片至少观察3个视野。

1.8统计学方法运用SPSS 16.0软件进行数据统计处理，子宫湿质量、子宫指数利用单因素方差分析进行统计比较；免疫组化及原位杂交所得结果利用Kruskal-WallisH检验及Mann-WhitneyU检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组大鼠体质量、子宫湿质量及子宫指数比较各组大鼠体质量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。各给药组子宫湿质量、子宫指数均明显高于生理盐水组、老年组(P均<0.05)；更年汤组子宫湿质量、子宫指数与青年组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，与利维爱组、教材方组比较差异均有统计学意义(P均<0.05)；利维爱组子宫湿质量、子宫指数与教材方组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

2.2各组大鼠子宫组织中VEGF与VEGF mRNA阳性表达情况老年组和生理盐水组VEGF及VEGF mRNA阳性表达明显低于青年组(P均<0.05)。各给药组VEGF及VEGF mRNA的阳性表达明显高于生理盐水组、老年组(P均<0.05)，更年汤组、利维爱组VEGF及VEGF mRNA阳性表达明显高于教材方组(P均<0.05)，利维爱组VEGF及VEGF mRNA阳性表达与更年汤组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。各组大鼠子宫VEGF表达免疫组化表现见图1～6，各组大鼠子宫VEGF mRNA表达原位杂交图见图7～12。

表1　各组大鼠体质量、子宫湿质量、子宫指数比较±s)

注：①与利维爱组比较，P<0.05；②与教材方组比较，P<0.05；③与更年汤组比较，P<0.05。

表2　各组大鼠子宫VEGF与VEGF mRNA阳性

图1　青年组大鼠子宫VEGF表达免疫组化表现(呈强阳性)

图2　老年组大鼠子宫VEGF表达免疫组化表现(呈弱阳性)

图3　生理盐水组大鼠子宫VEGF表达免疫组化表现(呈弱阳性)

图4　教材方组大鼠子宫VEGF表达免疫组化表现(呈中度阳性)

图5　利维爱组大鼠子宫VEGF表达免疫组化表现(呈强阳性)

图6　更年汤组大鼠子宫VEGF表达免疫组化表现(呈强阳性)

图7　青年组大鼠子宫VEGF mRNA表达原位杂交图(呈中度阳性)

图8　老年组大鼠子宫VEGF mRNA表达原位杂交图(呈弱阳性)

图9　生理盐水组大鼠子宫VEGF mRNA表达原位杂交图(呈弱阳性)

图10　教材方组大鼠子宫VEGF mRNA表达原位杂交图(呈中度阳性)

图11　利维爱组大鼠子宫VEGF mRNA表达原位杂交图(呈强阳性)

图12　更年汤组大鼠子宫VEGF mRNA表达原位杂交图(呈强阳性)

3讨论

对于绝经期综合征的治疗，西医主要以性激素替代疗法为主，虽然临床证明疗效确切但不良反应明显，使其运用受到很大限制。所以从天然药物中寻找具有激素样生物活性而又无损身体健康的治疗药物很有现实意义。对于绝经前后肾阳虚及肾阴阳俱虚之证，笔者以中医理论为指导，结合多年的临床经验，总结出肾中阴阳失调是其发病的基础，经络闭阻是其发病的重要环节，肾虚寒凝是其基本病机，提出了补肾温阳、祛风散寒的基本治疗大法，并在此基础上设立了自拟更年汤作为治疗经断前后诸证的基本方剂。方中熟地、当归滋阴补肾，填精益髓；山药健脾益气，补后天以充先天；山茱萸滋补肝肾，固涩精气；仙茅、仙灵脾、巴戟天温肾壮阳，强筋骨，袪风湿；旱莲草、女贞子、桑寄生补肝肾，强筋骨；桂枝、独活、防风、细辛发散风寒，温通经脉，祛下焦湿邪痹痛；炙甘草益气补中，调和诸药。全方以补肾、调和肾中阴阳为主，配合祛风散寒、除湿通络之除湿药以治疗绝经前后肾虚、肾阴阳失调，经络闭阻之证。 前期研究已证实自拟更年汤治在调节生殖内分泌、延缓卵巢衰退方面有良性作用，且安全[4-6]。本实验采用子宫增加质量法进一步探讨更年汤治疗经断前后诸证的作用机制。

子宫增加质量法检测药物的雌激素活性是一种最常用的评价雌激素作用的方法[7]，其灵敏度高，可直接反映受试物的活性,并可用于多种外来雌激素的检测等。其原理主要是子宫含有大量的雌激素受体(ERs),雌激素或具有雌激素活性的化合物通过与该受体结合,可诱发细胞内反应,使子宫的雌激素诱导蛋白(IPs)含量增加,表现为子宫组织增生变厚而使子宫质量增加。随着机体进入围绝经期，卵巢功能的衰退，性激素分泌水平的降低，将引起全身诸多组织器官结构和功能的退行性改变。子宫是卵巢激素的主要靶器官，子宫是围绝经期衰老进程中受影响较为明显的器官。本研究结果显示，青年组的大鼠子宫湿质量、子宫指数最高，而老年组大鼠则是最低的；给药后更年汤组、教材方组、利维爱组的子宫湿质量、子宫指数明显高于生理盐水组，表明3种药物均可促进模型大鼠子宫质量增加，其中更年汤较利维爱、教材方作用更为显著，说明更年汤具有雌激素样作用，且活性较强。

VEGF是组织细胞产生的一种血管内皮细胞特异性有丝分裂原,在血管生成和血管通透性的生理病理过程中有着重要作用[8]。VEGF与血管发生和发展紧密联系在一起,在个体胚胎发育过程中有广泛的表达,如胚胎和出生后脑室的神经外胚层、脑垂体、肾脏、肾上腺、卵巢、子宫内膜和胎盘等正常组织，与女性的生殖系统也密切相关，如血管化过程中的黄体、卵泡、子宫内膜周期和蜕膜、创伤炎症和肿瘤的生成过程均伴有VEGF的表达[9]。血管的分化、增殖与生成是维持子宫结构和功能的必要条件，而VEGF是促进子宫血管生成的关键因子。本实验观察到更年汤与利维爱能显著上调VEGF及VEGFmRNA的阳性表达,而雌二醇有促进VEGF合成和表达的作用[10-11]。提示自拟更年汤改善子宫老化、促进子宫质量增加的作用可能与其发挥雌激素样作用，调节血管新生基因的表达有关。

综上所述，补肾温阳、祛风散寒法之自拟更年汤可能通过调节VEGF的表达，促进肾阳虚型围绝经期模型大鼠子宫增重，发挥其雌激素样作用，达到治疗绝经期综合征的目的。

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Investigation of the estrogen-like activity of Gengnian decoction in the perimenopause model rats with deficiency of kidney-Yang

ZHANG Fan1, YI Huaya2, QI Shuaiying2, WU Chuangxin2, FANG Li2, YANG Yutao1

(1.The Second Affiliated Hospital of Guiyang College of Traditional Chinese Medicine,Guiyang 550002, Guizhou, China; 2.Guiyang College of Traditional Chinese Medicine,Guiyang 550002, Guizhou, China)

Abstract:Objective It is to explore estrogen-like activity of Gengnian decoction in the perimenopause model rats with deficiency of kidney-Yang.Methods We chose natural aging perimenopausal female SD rats model and injected hydrocortisone to build the rats model with deficiency of kidney-Yang. Then they were divided randomly into four groups: the Gengnian decoction group(A), the textbook decoction group(B)，the livial group(C) and the normal saline group(D). A young group (E)and an elderly group(F) SD female rats were chosen as the control groups. The perimenopause models with deficiency of kidney-Yang were established by muscle injection with hydrocortisone. All the rats in every group were treated with respective drug by gavage. After treating for 15 days, the rats were killed to remove their uterus to calculate their wet weight and the uterus index,and compare the positive expression of uterine VEGF, VEGF mRNA by immunohistochemical staining and in situ hybridization detection method. Results The index and wet weight of uterus in GroupA,B and C were increased significantly compared with Group D and Group F (P<0.05), and the difference between Group A and Group B, C was significant(P<0.05). There was no statistical significance between Group B and C (P>0.05). The GroupA,B and C could up-regulate the VEGF and VEGFmRNA Expression, but the level between GroupA, C and GroupB was different and hasstatistical significance (P<0.05). There was no significant difference between Group A and C (P>0.05). Conclusion The Gengnian decoction can increase weight of the uterine and has estrogen-like effects, and the mechanism through which to gain weight may have relationship with the positive expression of VEGF and VEGF mRNA decoction.

Key words:Gengnian decoction; deficiency of kidney-Yang; perimenopause; rat; VEGF

[收稿日期]2015-09-20

[中图分类号]R-332

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)02-0115-05

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.02.001

[基金项目]国家自然科学基金资助项目(81160491)

[作者简介]张帆，女，主任医师，硕士生导师，主要研究方向为中西医结合治疗妇女生殖内分泌相关疾病。[通信作者]易华娅，E-mail：847356542@qq.com