自拟更年汤对肾阳虚型围绝经期模型大鼠卵巢细胞凋亡相关因子的影响
2016-05-31武创新齐帅英易华娅
张 帆,武创新,齐帅英,易华娅
(1. 贵阳中医学院第二附属医院,贵州 贵阳 550002;2. 甘肃省华亭县人民医院,甘肃 华亭 744000;3. 辽宁省抚顺市中医院,辽宁 抚顺 113008;4. 贵阳中医学院,贵州 贵阳 550002)
论著
自拟更年汤对肾阳虚型围绝经期模型大鼠卵巢细胞凋亡相关因子的影响
张帆1,武创新2,齐帅英3,易华娅4
(1. 贵阳中医学院第二附属医院,贵州 贵阳 550002;2. 甘肃省华亭县人民医院,甘肃 华亭 744000;3. 辽宁省抚顺市中医院,辽宁 抚顺 113008;4. 贵阳中医学院,贵州 贵阳 550002)
[摘要]目的探讨自拟更年汤对肾阳虚型围绝经期模型大鼠卵巢组织形态学及卵巢颗粒细胞凋亡因子bax、bax mRNA、bcl-2、bcl-2 mRNA的影响。方法选用自然老化的围绝经期雌性SD大鼠,臀部肌肉左右交替肌注氢化可的松构建肾阳虚型围绝经期大鼠模型,将造模成功大鼠随机分为更年汤组、教材方组、利维爱组、生理盐水组;另选择4月龄SD雌性大鼠20只作为青年组,18月龄SD雌性大鼠20只作为老年组。青年组、老年组、生理盐水组均给予生理盐水灌胃,各给药组给予相应药物灌胃,灌胃15 d后处死大鼠,分离摘取双侧卵巢,运用病理切片观察卵巢组织大体形态,运用免疫组化及原位杂交法检测卵巢颗粒细胞凋亡因子bax、bax mRNA、bcl-2、bcl-2 mRNA表达情况。结果各给药组卵泡发育良好情况优于老年组和生理盐水组(P均<0.05),卵泡闭锁、卵泡扩张情况轻于老年组和生理盐水组(P均<0.05);自拟更年汤组与利维爱组卵泡发育良好情况优于教材方组(P均<0.05),自拟更年汤组与利维爱组比较差异无统计学意义(P>0.05);自拟更年汤组卵泡闭锁、卵泡扩张情况轻于教材方组和利维爱组(P均<0.05),教材方组与利维爱组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。各给药组bax、bax mRNA阳性表达明显低于老年组和生理盐水组(P均<0.05),bcl-2与bcl-2 mRNA阳性表达明显高于老年组和生理盐水组(P均<0.05);自拟更年汤组与利维爱组bax、bax mRNA阳性表达明显低于教材方组(P均<0.05),bcl-2与bcl-2 mRNA阳性表达明显高于教材方组(P均<0.05),自拟更年汤组bax、bax mRNA、bcl-2、bcl-2 mRNA阳性表达与利维爱组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。结论自拟更年汤能促进卵泡发育,抑制卵泡闭锁和扩张,能上调卵巢颗粒细胞抑制凋亡因子bcl-2、bcl-2 mRNA的阳性表达,抑制促凋亡因子bax、bax mRNA的阳性表达。
[关键词]自拟更年汤;围绝经期;肾阳虚;细胞凋亡因子
绝经期综合征是45~55岁女性的常见病,且近年来随着现代女性经济地位的提高,生活压力的增大,大环境的改变,使此病的发生有逐年上升的趋势。现在许多学者将细胞凋亡理论作为绝经期综合征的研究热点。本研究观察了自拟更年汤对肾阳虚型围绝经期模型大鼠卵巢组织形态学及颗粒细胞凋亡因子bax、bax mRNA、bcl-2、bcl-2 mRNA的影响,旨在为自拟更年汤治疗绝经期综合征提供实验依据。现将实验结果报道如下。
1实验资料
1.1实验药品自拟更年汤,组方:熟地12 g、怀山药12 g、枣皮12 g、仙茅12 g、仙灵脾12 g、巴戟天12 g、女贞子12 g、旱莲草12 g、桑寄生12 g、当归10 g、 桂枝9 g、独活9 g、防风9 g、细辛3 g、炙甘草6 g。教材方,组方:熟地、仙茅、仙灵脾各15 g,山药、杜仲、枣皮、菟丝子、知母各12 g,黄柏、当归各10 g,肉桂、甘草各6 g。生理盐水: 250 mL/2.25 g,贵州省科伦药业有限公司生产,国药准字H20033939。替勃龙片: 2.5 mg×7片/盒,南京欧加农制药有限公司生产,国药准字H20051085。
1.2主要试剂及仪器BAO412 bcl-2、BA0315-1 bax、进口大鼠原位杂交bcl-2(ISH-5116)、进口大鼠原位杂交bax(ISH-5136)均由贵州爱瑞达生物科技有限公司提供。生物显微图像分析仪(5.30-06064),摄影生物显微镜(XSZ-HS3),电热鼓风干燥箱(GZX-9030),4 ℃冰箱(Sc-Z19A),电磁炉(RC-200B型),恒温干燥箱,电子天平(JA2003N),台式低速离心机(L600)。
1.3实验方法选择4月龄、体质量180~200 g SD雌性大鼠20只作为青年组; 18月龄、体质量420~450 g SD雌性大鼠20只作为老年组。选择11~12月龄、体质量280~300 g SD雌性大鼠80只置于贵阳中医学院中心动物室适应性饲养1周,实验期间在同一室内笼养,12 h光照、12 h黑暗的条件下,每日更换饮水,给予足够颗粒饲料,室温18~22 ℃,以阴道脱落细胞角化试验验证模型,结果均观察到底层细胞均在50%以上,涂片呈现为动情周期紊乱、动情间期延长,证明为围绝经期。之后每日常规消毒后左右交替于模型大鼠臀部肌肉丰厚的部位注射氢化可的松0.5 mL/100 g,连续肌注9 d,间停4 d。见动物出现持续性萎靡不振、反应迟钝、扎堆、拱背少动、毛不光洁、竖毛时则认为肾阳虚型模型造模成功。将造模成功的大鼠随机分为自拟更年汤组、教材方组、利维爱组、生理盐水组,每组20只。各给药组给药剂量均按人鼠体质量换算,人体质量按60kg计算,人与大鼠的等效剂量比值为1∶6~7,剂量以mg/kg表示。更年汤组、教材方组、利维爱组分别给予更年汤溶液[含生药量1.8 g/mL,约18 g/(kg·d)]、教材方溶液[含生药量1.6 g/mL,约16 g/(kg·d)]、利维爱溶液[含药量0.029 4 mg/mL,约0.294 mg/(kg·d)]各4 mL灌胃,青年组、老年组、生理盐水组均给予生理盐水4 mL灌胃,均1次/d,连续15 d。因动物之间的相互撕咬、灌胃时操作不当以及大鼠对麻醉药物乌拉坦的耐受较差导致动物死亡,至采集标本时,大鼠的数量青年组13只、老年组13只、生理盐水组13只、更年汤组16只、教材方组15只、利维爱组14只。末次给药24 h后,先用20%乌拉坦根据大鼠体质量按0.5 mL/100 g腹腔给药麻醉,确认麻醉生效股动脉放血处死,即刻剖腹摘取大鼠双侧卵巢,运用病理切片观察卵巢组织大体形态,运用免疫组化及原位杂交法检测大鼠卵巢颗粒细胞凋亡因子bax、bax mRNA、bcl-2、bcl-2 mRNA表达情况,具体实验方法严格参照试剂盒说明。
1.4免疫组化及原位杂交判定标准[1]在显微镜下根据切片中标记蛋白及mRNA染色的深浅分4级:未被染色的为阴性表达(-),浅棕色为弱阳性表达(+),棕黄色为中度阳性表达(),棕褐色为强阳性表达()。为了统计方便,将“-、+、、”分别计为0,1,2,3分。
1.5统计学方法应用SPSS 16.0统计软件进行统计学处理,整体比较用多个独立样本的非参数检验,组间等级资料的两两样本比较用两个独立样本的非参数检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1各组大鼠卵巢病理切片表现6组间卵泡发育良好、卵泡闭锁、卵泡扩张情况比较差异有统计学意义(P均<0.05)。老年组与生理盐水组卵泡发育良好情况低于青年组(P均<0.05),卵泡闭锁、卵泡扩张情况重于青年组(P均<0.05);各给药组卵泡发育良好情况优于老年组和生理盐水组(P均<0.05),卵泡闭锁、卵泡扩张情况轻于老年组和生理盐水组(P均<0.05);自拟更年汤组与利维爱组卵泡发育良好情况优于教材方组(P均<0.05),自拟更年汤组与利维爱组比较差异无统计学意义(P>0.05);自拟更年汤组卵泡闭锁、卵泡扩张情况轻于教材方组和利维爱组(P均<0.05),教材方组与利维爱组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。
表1 各组大鼠卵巢病理切片表现 只
2.2各组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡因子bax与bax mRNA表达情况6组间bax、bax mRNA阳性表达情况比较差异有统计学意义(P<0.05)。老年组与生理盐水组bax、bax mRNA阳性表达高于青年组(P均<0.05),各给药组bax、bax mRNA阳性表达明显低于老年组和生理盐水组(P均<0.05),自拟更年汤组与利维爱组bax、bax mRNA阳性表达明显低于教材方组(P均<0.05),自拟更年汤组与利维爱组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表2。
表2 各组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡因子bax与bax mRNA表达情况 只
2.3各组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡因子bcl-2与bcl-2 mRNA表达情况6组间bcl-2与bcl-2 mRNA阳性表达情况比较差异有统计学意义(P均<0.05)。老年组与生理盐水组bcl-2与bcl-2 mRNA阳性表达低于青年组(P均<0.05),各给药组bcl-2与bcl-2 mRNA阳性表达明显高于老年组和生理盐水组(P均<0.05),自拟更年汤组与利维爱组bcl-2与bcl-2 mRNA阳性表达明显高于教材方组(P均<0.05),自拟更年汤组与利维爱组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表3。
3讨论
表3 各组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡因子bcl-2与bcl-2 mRNA表达情况 只
卵巢为女性的性腺,卵泡自胚胎形成后即进入自主发育和闭锁的轨道,出生时卵泡约有200万个,随着人体的生长发育,卵泡自行凋亡,到青春期约剩下30万个。卵泡发育良好的表现是卵巢内卵泡的数量较多,形态结构正常,未发生变异;卵泡闭锁的表现是卵泡结构被破坏,体积缩小,卵泡腔缩小;卵泡扩张的表现是卵泡原有的结构破坏,体积增大,卵泡腔扩大。女性到51岁时, 卵巢中约剩下1 000个发育不良或无功能性的卵泡, 标志着绝经的来临[2]。围绝经期的女性,由于功能性卵泡的闭锁,使生育功能完全丧失,卵巢的内分泌功能失常,合成的雌激素减少,从而导致一系列躯体和生理的病理表现。目前很多研究证实细胞凋亡受多种基因调节,其中最重要的有bcl-2家族、P53等凋亡相关基因,bcl-2家族可以分为2大组,其中抑制细胞凋亡的有bcl-2,促进细胞凋亡的有bax[3]。现代医学较一致的观点认为卵巢颗粒细胞凋亡受bcl-2、bax基因调控,卵巢颗粒细胞凋亡,触发卵泡闭锁,颗粒细胞产生雌激素减少,促性腺激素受体减少,从而引发围绝经期综合征(PMS)[4-5]。生长卵泡的颗粒细胞中存在bcl-2的优势表达。bax的表达通过线粒体途径介导,而后诱导细胞色素C从线粒体释放,继而激活caspase-3、caspase-9,引发caspases级联反应,导致颗粒细胞凋亡[6]。
自拟更年汤实为六味地黄丸、二仙汤、二至丸与独活寄生汤加减化裁而成,大多数医家认为绝经期综合征病位在肾,肾虚为本。肾为先天之本,主生殖,同时也是“五脏六腑之本,十二经脉之根”,其与女性的月经、生殖密切相关。笔者在临床中发现肾阳虚及阴阳俱虚之患者单以补肾温阳滋阴方法治疗效果不太理想,肾阳虚则对机体各脏腑组织器官的推动、温煦作用减弱,各脏器的阴阳之间失去平衡。肾气虚衰,气血虚弱无力推动血液的运行、津液的生成输布和排泄,影响各脏腑功能的正常发挥,导致经络阻滞;阳虚失于温煦,卫护肌表、防御作用减弱,可见卫表不固,风寒湿邪易于侵犯肌肤;所以笔者认为绝经前后妇女肾虚与经络阻滞、外邪犯表同在,肾虚为本,经络闭阻为标,故遵循中医标本同治的原则,在治疗上提出了补肾温阳、祛风散寒的全新治疗思想,补肾与祛风通络双管齐下,温补肾阳,温煦内寒,驱散外寒,能显著改善绝经前后诸证的肾阳虚证或肾阴阳两虚证的临床症状。但自拟更年汤对卵巢颗粒细胞凋亡因子bax、bax mRNA、bcl-2、bcl-2 mRNA的影响尚不明确,故进行了相关实验研究。
本实验中之所以选择SD雌性大鼠,因为对豚鼠、小鼠、大鼠和猴研究发现, 只有大鼠和猴出现与生殖功能降低有关的潮热症状[7-8],加之大鼠价格较低、易于获得、易于饲养,所以大鼠通常作为绝经模型首选。目前大鼠围绝经期模型分为卵巢去势型、自然衰老型。雌性大鼠从11月龄开始就进入更年期, 这与人更年期生物学特性相仿,且自然衰老的大鼠比较符合人类围绝经期变化过程,同时可以避免因手术摘除卵巢造成动物死亡,因此本实验选择11~12月龄大鼠作为围绝经期模型大鼠。结果显示,自拟更年汤能促进围绝经期模型大鼠卵巢卵泡的良好发育,减少卵泡的闭锁和扩张,从而促进卵巢部分功能的恢复;而且自拟更年汤能抑制模型大鼠卵巢颗粒细胞促凋亡因子bax及bax mRNA的阳性表达,增加模型大鼠卵巢颗粒细胞抑制凋亡因子bcl-2及bcl-2 mRNA的阳性表达。
综上所述,自拟更年汤能抑制卵泡的闭锁和扩张,促进卵泡的良好发育,能上调卵巢颗粒细胞抑制凋亡因子bcl-2、bcl-2 mRNA的阳性表达,抑制促凋亡因子bax、bax mRNA的阳性表达,从而能抑制模型大鼠卵巢颗粒细胞的凋亡,延缓卵巢的衰老。本实验只对细胞凋亡起主要作用的bcl-2、bax进行了研究,不能全面阐述细胞凋亡多基因间的相互作用,期望在以后的实验中进一步探讨有关引起卵巢颗粒细胞凋亡的作用机制。
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Effect of Gennian docoction on ovarian cell apoptosis-related factors in the rats with perimenopause of Kidney-Yang deficiency type
ZHANG Fan1,WU Chuangxin2,QI Shuaiying3,YI Huaya4
(1.The Second Affiliated Hospital of Guiyang College of TCM, Guiyang 550002, Guizhou, China;2.The People’s Hospital of Huating County, Huating 744000, Ganzu, China; 3.Fushun Hospital of TCM, Fushun 113008, China; 4.Guiyang College of TCM, Guiyang 550002, Guizhou, China)
Abstract:Objective It is to evaluate the effect of Gengnian decoction on ovarian tissue morphology,bax ,bax mRNA,bcl-2,bcl-2 mRNA which is one of apopcosis factor of Kidney-Yang deficiency type perimenopause rat’ ovarian granulosa cells.Methods To build natural aging perimenopause model rats by selecting the exfoliated cervicall cells of female SD rats on 11-14 months age and intramuscular injection altemately hydrocortisone to build the rat model with Kidney-Yang deficiency type perimenopause. Then the models were randomly divided into four groups: Gennian decoction group, textbook group, Livial group and normal saline group.At the same time, the study chose four-month-old female SD rats and eighteen-month-old female SD rats as compared group. The young group, elderly group and normal saline group were treated with normal saline by gavage, every treatment group were treated with respective drug by gavage. After treatment accordingly, by adopting pathological sections to understand morphological changes of rats’ ovarian,adopting Immunohistochemistry and in Situ Hybridization technique to compare the positive expression of ovarian granulose cell bax,bax mRNA,bcl-2,bcl-2 mRNA in every group. Results Each dosage groups compared with normal saline group, the elderly group, follicular development situation were well (P<0.05), follicular atresia, follicle expansion were reduced (P<0.05); The Gengnian decoction and Livial group of follicular situation was superior to the textbooks party group (P<0.05), and the difference between the two groups had no statistical significance (P>0.05). The follicular atresia, follicle expansion in Gengnian decoction group were better than that in Livial group, textbooks group (P<0.05), the textbook group compared with the Livial group had no statistical significance (P>0.05). Each dosage groups compared with normal saline group, the elderly group, bax, bax mRNA positive expression were lower (P<0.05), the bcl-2 and bcl-2 mRNA positive expression had raised (P<0.05); The Gengnian Decoction and Livial group's bax, bax mRNA positive expression were lower than that in group teaching material side (P<0.05), the bcl-2 and bcl-2 mRNA positive expression were significantly higher than textbooks party group (P<0.05), there was no statistically significant difference between Gennian decoction and Livial group(P>0.05).Conclusion Gengnian decoction can promote follicular development, inhibit follicular atresia and expansion, up-regulate the positive expression of bcl-2 and bcl-2 mRNA, down-regulate the positive expression of bax and bax mRNA in ovarian granulosa cells.
Key words:Gengnian decoction; perimenopause; Kidney-Yang deficiency; cell apoptosis factor
[收稿日期]2015-09-25
[中图分类号]R-332
[文献标识码]A
[文章编号]1008-8849(2016)08-0799-04
doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.08.001
[基金项目]国家自然科学基金资助项目(81160491)
[作者简介]张帆,女,主任医师,硕士生导师,主要研究方向为中西医结合治疗妇女生殖内分泌相关疾病。[通信作者]齐帅英,E-mail:455729354@qq.com