丹参酮ⅡA通过调节miR-133水平对慢性心力衰竭心肌重构的影响

冯　俊，陈华文

(华中科技大学同济医学院附属同济医院，湖北 武汉 430030)



丹参酮ⅡA通过调节miR-133水平对慢性心力衰竭心肌重构的影响

冯俊，陈华文

(华中科技大学同济医学院附属同济医院，湖北 武汉 430030)

[摘要]目的探讨丹参酮ⅡA是否能通过调控miR-133水平影响慢性心力衰竭大鼠心肌重构。方法将SD大鼠随机分为假手术组、手术组、丹参酮ⅡA组、 miR-133抑制剂组，每组10只。除假手术组外，其余组大鼠均行腹主动脉缩窄术建立心力衰竭模型。各组均正常喂养4周后，丹参酮ⅡA组和miR-133抑制剂组均给予丹参酮ⅡA磺酸钠注射液灌胃，miR-133抑制剂组同时皮下植入渗透泵持续泵入miR-133拮抗剂antagomirs，假手术组、手术组给予等容积生理盐水灌胃，均连续12周。末次灌胃后24 h检测各组大鼠心功能，取心脏计算心脏指数及左心室质量指数，HE染色观察大鼠心肌形态学变化，Masson染色观察大鼠心室肌胶原变化。结果与假手术组比较，手术组心功能恶化(P<0.05)，心脏指数及左心室质量指数、心肌细胞直径和胶原含量增加(P均<0.05)；丹参酮ⅡA组和miR-133 抑制剂处理组上述各指标均较手术组明显改善(P均<0.05)，但丹参酮ⅡA组上述各指标改善情况均明显优于miR-133抑制剂处理组(P均<0.05)。结论miR-133在丹参酮ⅡA抗心力衰竭大鼠左心室重构中发挥着重要作用，丹参酮ⅡA可能通过上调miR-133水平发挥抗心力衰竭心肌重构的作用。

[关键词]丹参酮ⅡA；miR-133；心力衰竭；心肌重构

心力衰竭是各种心脏疾病的严重阶段，而心室肌重构是心力衰竭的独立危险因素，随着心室肌组织重构的发生及发展，可导致心肌组织缺氧缺血状态的逐渐加重，从而引起心室顺应性的下降，最终导致心肌缺血、心律失常和猝死[1]。因此防治和逆转心肌重构是治疗心力衰竭的重点。相关研究发现，我国传统中药丹参的主要成分丹参酮ⅡA具有抗缺氧缺血、改善微循环、抑制血小板黏附聚集等保护心血管作用，因此广泛应用于临床[2-4]；笔者的前期研究已经发现，丹参酮ⅡA可以升高心力衰竭大鼠下降的miR-133 mRNA水平[5]。本实验研究在前期研究的基础上观察了丹参酮ⅡA能否通过调控miR-133水平影响心力衰竭大鼠整体心肌结构重构，现将结果报道如下。

1实验资料

1.1实验动物健康成年雄性SD大鼠40只，月龄2个月，体质量250～300 g，同济医学院动物实验中心提供，动物合格证号：SCXK鄂2009-0003。

1.2药物及试剂丹参酮ⅡA磺酸钠注射液(上海第一生化药业有限公司产品),miR-133拮抗剂antagomirs[宝生物(大连)有限公司]，其余试剂为国产分析纯，武汉康盛医药科技有限公司产品。

1.3实验方法将SD大鼠随机分为假手术组、手术组、丹参酮ⅡA组、miR-133抑制剂组，每组10只，4组大鼠均于同一环境下饲养。除假手术组外，其余组大鼠均采用腹主动脉缩窄法(AAC)构建慢性心力衰竭大鼠模型:10%水合氯醛(0.3 mL/kg)腹腔麻醉，仰位固定，腹部常规备毛、消毒，于腹中线开腹处理，暴露分离腹主动脉，8号针头平行置于腹主动脉旁后采用手术缝线(4/0)将两者结扎，随后抽出针头关闭腹腔。术后腹腔注射青霉素抗感染。假手术组只分离腹主动脉，不结扎。各组均正常喂养4周。从第5周开始，丹参酮ⅡA组和miR-133抑制剂处理组均给予丹参酮ⅡA磺酸钠注射液1 mL/(kg·d)灌胃，miR-133拮抗剂组同时皮下植入渗透泵持续泵入miR-133拮抗剂antagomirs(0.6 μmol/L)，假手术组、手术组给予等容积生理盐水灌胃，均连续12周。

1.4观察指标

1.4.1心功能末次灌胃后24 h,10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠， 仰卧固定四肢，胸前区剃毛，使用GEViVid 7彩色超声显像仪检测心功能指标舒张末期左室后壁厚度(LVPWTd)、收缩末期左室后壁厚度(LVPWTs)、舒张末期室间隔厚度(IVSTd)、收缩末期室间隔厚度(IVSTs)、舒张末期左室内径(LVEDD)、收缩末期左室内径(LVESD)、左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(FS)。

1.4.2心脏指数(HWI)及左心室质量指数(LVMI)各组大鼠静脉注射过量的氯化钾(可使心脏止于收缩期)后迅速取出心脏称质量，并分离大血管、心房及右心室，用预冷的PBS液充分冲洗，滤纸吸干，称量左心室(包括室间隔)的湿质量，以心脏(mg)与体质量(g)之比作为HWI，左室质量(mg)与体质量(g)之比作为LVMI。

1.4.3心肌形态学变化情况将大鼠心脏用4%甲醛固定，梯度乙醇脱水后，取心尖部组织进行石蜡包埋和切片(5 μm)，行HE染色，观察心肌组织结构形态学变化。

1.4.4心室肌胶原变化情况将左心室中部冠状切面的心肌组织用4%多聚甲醛固定后制备成石蜡包埋切片(5 μm)，脱蜡至水，按照Masson试剂盒指示方法进行染色，胶原纤维呈蓝色，心肌纤维呈红色，胞核呈黑蓝色。观察心肌胶原纤维含量变化。

2结果

2.1各组超声心动图指标比较手术组LVPWTd、LVPWTs、IVSTs、IVSTd 、LVEDD、LVESD均显著高于假手术组(P均<0.05)，LVEF、FS均显著低于假手术组(P均<0.05)；丹参酮ⅡA组和miR-133抑制剂组LVPWTd、LVPWTs、IVSTs、IVSTd 、LVEDD、LVESD均显著低于手术组(P均<0.05)，LVEF、FS均显著高于手术组(P均<0.05)；但miR-133抑制剂组LVPWTd、LVPWTs、IVSTs、IVSTd、LVEDD、LVESD均显著高于丹参酮ⅡA组(P均<0.05)，LVEF、FS均显著低于丹参酮ⅡA组(P均<0.05)。见表1。

表1　各组大鼠超声心动图检测结果比较±s)

注：①与假手术组比较，P<0.05；②与手术组比较，P<0.05；③与丹参酮ⅡA组比较，P<0.05。

2.2各组HWI和LVWI比较手术组HWI和LVMI均显著高于假手术组(P均<0.05)。丹参酮ⅡA组和miR-133抑制剂处理组HWI和LVMI均明显低于手术组(P均<0.05)，而miR-133抑制剂处理组HWI和LVMI均明显高于丹参酮ⅡA组(P均<0.05)。见表2。

2.3各组心肌形态学HE染色表现假手术组镜下见心肌纤维排列正常，无血管扩张及血管壁增厚等表现；手术组心肌细胞直径增大，细胞排列不整齐，着色不匀，肌纤维束较宽大，肌纤维间疏松水肿，间隙增宽，部分肌束间纤维结缔组织增生，血管周围胶原纤维增生更为明显，间质中还可见炎症细胞浸润等改变；丹参酮ⅡA组心肌肥大、细胞核增大、心肌胶原纤维增生程度较手术组明显改善，而miR-133抑制剂组上述病理改变较丹参酮ⅡA组明显。见图1～4。

2.4各组心肌胶原Masson染色表现正常心肌细胞呈红色，胶原呈绿色。假手术组心肌间隙可见少量胶原纤维，排列整齐；手术组大鼠心肌间隙见大量胶原堆积，并有微瘢痕形成，心肌纤维排列紊乱，间质胶原纤维增生，以血管周围为明显，非血管区胶原纤维增生程度比血管周围轻；丹参酮ⅡA组可见不同程度胶原沉积于细胞间质，胶原纤维排列紊乱，间质纤维增生，以血管周围为明显，但总体胶原纤维增生程度较手术组明显减轻；miR-133 抑制剂处理组胶原纤维增生程度较丹参酮ⅡA组明显。见图5～8。

表2　各组大鼠HWI和LVWI比较

注：①与假手术组比较，P<0.05；②与手术组比较，P<0.05；③与丹参酮ⅡA组比较，P<0.05。

图1　假手术组大鼠心肌HE染色表现

图2　手术组大鼠心肌HE染色表现

图3　丹参酮ⅡA组大鼠心肌HE染色表现

图4　miR-133抑制剂组大鼠心肌HE染色表现

3讨论

图5　假手术组大鼠心肌胶原Masson染色表现

图6　手术组大鼠心肌心肌胶原Masson染色表现

图7　参酮ⅡA组大鼠心肌心肌胶原Masson染色表现

图8　miR-133抑制剂组大鼠心肌心肌胶原Masson染色表现

近年来，心血管疾病越来越成为危害人类健康的杀手之一，尤其是心肌梗死和心力衰竭。研究表明，左心室重构是心力衰竭发生、发展的基本机制，是心功能由代偿期向失代偿期转变的关键[6]。预防和抑制心室重构的发生和发展是目前治疗心力衰竭的重点方向，找到一个有效物质来阻止和减缓心力衰竭的发生就变得尤其重要，也是改善预后的主要措施。

丹参酮ⅡA是中药丹参根的乙醚提取物中的脂溶性有效成分，其具有防止过氧化氢对血管内皮细胞造成损伤的作用[7]，而且具有改善心肌缺血、抗急性缺氧、抗心肌肥厚、逆转左心室重构的作用，可以降低恶性心律失常的发生率[8]。目前研究已证明丹参酮ⅡA能治疗各种原因导致的慢性心力衰竭，能明显改善心功能[9-10]。

本实验用AAC法建立慢性心力衰竭大鼠模型，发现手术组术后心肌细胞肥大，细胞核增大深染，心肌纤维增生伴炎症细胞浸润；Masson染色显示大量心肌胶原沉积，间质胶原纤维增生。给予丹参酮ⅡA处理后，大鼠心功能、心肌形态学以及心肌胶原含量明显改善，提示丹参酮ⅡA可抑制和逆缓左心室重构。此外，本研究为证明丹参酮ⅡA是否通过调控miR-133来抑制心力衰竭大鼠左心室重构，设立了miR-133抑制剂组，即在给予AAC大鼠丹参酮ⅡA处理的同时皮下植入渗透泵连续泵入antagomirs。antagomirs是与胆固醇分子耦联的寡聚核苷酸，可与细胞质内的成熟mircoRNA特异性结合，从而阻止mircoRNA与其特定mRNA结合[11]，而针对miR-133设计的antagomirs可有效的沉默miR-133。antagomirs在体内非常稳定，经静脉注射后，沉默体内特异性miRNA的时间长达1周[12]。本研究结果显示，经antagomirs处理后，心肌细胞肥大、胶原增生、心功能较丹参酮ⅡA组恶化，表明antagomirs可以下调miR-133的表达，从而部分消除丹参酮ⅡA抗心力衰竭大鼠左心室重构的作用。

综上所述，miR-133在丹参酮ⅡA抗心力衰竭大鼠左心室重构中发挥着重要的作用，丹参酮ⅡA可能通过上调miR-133水平发挥抗心力衰竭心肌重构的作用。此研究为慢性心力衰竭的治疗提供了临床思路，即可基因水平治疗心血管疾病，而且miR-133可能成为新的诊断工具，并可能成为药物的治疗靶点。

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Effect of Tanshinone ⅡA on myocardial remodeling in rats with heart failure by regulating the level of miR-133

FENG Jun，CHEN Huawen

(Tongji Hospital Affiliated to Tongji Medical College,HuaZhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，Hubei, China)

Abstract:Objective It is to investigate the effect of miR-133 on myocardial remodeling in rats with chronic heart failure induced by Tanshinone ⅡA. Methods SD rats were randomly divided into sham operation group, operation group, Tanshinone ⅡA group, miR-133 inhibition group, each group had 10 rats. All the rats in every group except in sham operation group were given abdominal aortic constriction (AAC) to establish chronic heart failure. All the rats were normally fed for 4 weeks, then Tanshinone ⅡA group, miR-133 inhibition group were respectively treated with Tanshinone ⅡA by gavage and antagomirs by implantable “osmotic pumps”, sham operation group and operation group were given the same dose of normal saline by gavage. All the rats were treated for 12 weeks. Cardiac function, cardiac index, left ventricular mass index,morphology and pathological changes were analyzed in 24 h after the end gavage. Results Compared with sham group, cardiac function got worse, cardiac index,left ventricular mass index, cardiac muscle cell diameter and collagen content increased in operation group(P<0.05); the indexes above were obviously improved in Tanshinone ⅡA treatment group and miR-133 inhibition group(P<0.05), and the improvements in the former group were more significant. Conclusion miR-11 plays an important effect in anti-remodeling of left ventricular in the rats with heart failure, Tanshinone ⅡA maybe resist the cardiac remodeling of heart failure rats by up regulating miR-133 levels.

Key words:Tanshinone ⅡA; miR-133; heart failure; cardiac remodeling

[收稿日期]2015-11-02

[中图分类号]R-332

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)08-0803-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.08.002

[基金项目]国家自然科学基金资助项目(81202825)；湖北省自然科学基金资助项目(2012FFB02410)

[作者简介]冯俊，男，博士，副主任医师，研究方向为心血管疾病。[通信作者]陈华文， E-mail:andyterry555@163.com