P-JAK2/P-STAT3与突变型p53蛋白在宫颈病变中的表达及临床意义

马慧，尹利荣△，王芳，李洪林，单舒



P-JAK2/P-STAT3与突变型p53蛋白在宫颈病变中的表达及临床意义

马慧1，尹利荣1△，王芳2，李洪林2，单舒2

摘要:目的探讨宫颈病变中磷酸化JAK激酶2（P-JAK2）、磷酸化信号转导与转录因子3(P-STAT3)及突变型p53蛋白的表达及其临床意义。方法选取我科收治的宫颈鳞癌（SCC组）57例、低级别上皮内瘤变（LSIL组）36例、高级别上皮内瘤变（HSIL组）30例和正常宫颈（NC组) 30例为研究对象，检测各组高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV）感染情况，行HE染色、免疫组化检测P-JAK2、P-STAT3及突变型p53蛋白表达情况。结果（1）SCC组的HRHPV感染率、P-JAK2阳性表达率高于HSIL组、LSIL组及NC组(P＜0.05 )。（2）SCC组的P-STAT3、突变型p53阳性表达率高于LSIL组、NC组(P＜0.05 )，与HSIL组比较差异无统计学意义。（3）SCC组的P-JAK2和P-STAT3的阳性表达率在不同的FIGO分期、组织分化、淋巴结转移、HR-HPV感染亚组中有明显差异（均P＜0.05）；突变型p53的阳性表达率在不同的FIGO分期、HR-HPV感染亚组中具有显著差异（P＜0.05）。（4）SCC组中P-JAK2与P-STAT3、突变型p53的阳性表达率、HR-HPV感染率均呈正相关(P＜0.05)，P-STAT3与突变型p53的表达率、HR-HPV感染率呈正相关(P＜0.05)；突变型p53表达与HR-HPV感染呈正相关(P＜0.05)。结论P-JAK2、P-STAT3与突变型p53蛋白在SCC组中的表达水平高于正常组及上皮内瘤变组，三者可能与HR-HPV感染、宫颈鳞癌发生、进展有关。

关键词：磷酸化JAK激酶2；磷酸化信号转导与转录因子3;突变型p53；宫颈鳞癌；高危型人乳头瘤病毒；宫颈上皮内瘤变；免疫组织化学

△通讯作者E-mail:yinlirongfk@sina.com

宫颈癌（cervical carcinoma, CC）是女性常见的恶性肿瘤之一，近年来发病呈年轻化趋势。世界范围内，宫颈癌在女性恶性肿瘤发病率中位居第二位，其中以鳞癌为主，约占75%～80%，其致病因素包括人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染、癌基因激活、抑癌基因失活、错配修复基因突变、端粒酶基因的异常表达及不良生活方式等[1]。JAK激酶2（JAK2）是一种非受体酪氨酸激酶，细胞信号可刺激其磷酸化，作用于信号转导与转录因子3 （STAT3）；STAT3磷酸化后结合于细胞核内特异的DNA位点，作为一种转录激活因子调节靶基因的表达，继而调控细胞增殖、分化和凋亡，与肿瘤发生及发展密切相关[2]。野生型p53是一种与细胞增殖、分化有关的抑癌基因，在修复基因突变、调控细胞周期、促进细胞凋亡等方面具有重要作用，多种癌变组织中存在p53突变[3]。已有研究表明宫颈癌中磷酸化JAK2（P-JAK2）、磷酸化STAT3（P-STAT3）、野生型p53表达及HPV感染之间存在关联[4]，但是宫颈癌组织中大多数的野生型p53存在突变，目前关于P-JAK2、P-STAT3、突变型p53及高危型HPV（HRHPV）在宫颈病变组织中表达情况的研究较少。本研究通过检测宫颈病变组织及正常组织中P-JAK2、P-STAT3与突变型p53蛋白的表达及HR-HPV感染情况，以期探讨四者与宫颈鳞癌发生、发展的关系及临床意义。

1　资料与方法

1.1标本来源选取我院妇科2013年12月—2015年6月收治的宫颈鳞癌患者57例（SCC组）、高级别上皮内瘤变（HSIL）患者30例（HSIL组）、低级别上皮内瘤变（LSIL）患者36例（LSIL组），因子宫良性病变行全子宫切除的正常宫颈（NC组)30例为对照。入组患者年龄28～72岁，平均（46.15±3.24）岁，宫颈取材前均未进行放疗、化疗，无免疫系统疾病、先天性遗传病、严重内科疾病及其他恶性疾病。所有研究对象的临床及病理资料完整。

1.2试剂HR-HPV基因芯片法检测试剂盒、链霉亲和素-过氧化物酶（SP）免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒、鼠抗人单克隆抗体p53（突变型，克隆号Do7）购自北京中杉金桥生物技术有限公司，兔抗单克隆抗体P-JAK2（p-Tyr1007/ Tyr1008）购自abcam公司，兔抗人单克隆抗体P-STAT3 （Tyr705 D3A7）购自CST公司。

1.3方法

1.3.1标本收集刷取宫颈上皮脱落细胞，用于检测HRHPV。钳取患者宫颈组织，置入有10%福尔马林溶液的EP管中，石蜡包埋并切片，厚度为4 μm。

1.3.2基因芯片法检测HR-HPV按照试剂盒操作步骤，提取脱落细胞DNA，PCR扩增目的片段，基因芯片检测并读取结果。应用HR-HPV病毒感染分析报告系统检测HR-HPV各型别，信号位置灰度值与背景灰度值差大于4代表存在该型别HPV感染。

1.3.3HE染色宫颈组织石蜡包块脱蜡，苏木素伊红(HE)染色，脱水、封片。

1.3.4免疫组化按照免疫组化常规方法脱蜡与水化。PBS液冲洗，加3%H2O2去离子水孵育，PBS冲洗，抗原修复，PBS冲洗，正常山羊血清封闭。滴加兔抗单克隆抗体P-JAK2（p-Tyr1007/Tyr1008）、兔抗人单克隆抗体P-STAT3（Tyr705 D3A7）、鼠抗人单克隆抗体p53（突变型，克隆号Do7），4℃过夜。PBS冲洗，滴加辣根过氧化物酶标记的免疫组化二抗，室温条件孵育，PBS冲洗，滴加SP。室温条件孵育，PBS冲洗。加DAB显色液，自来水冲洗，苏木素复染，自来水冲洗。常规脱水、透明、中性树胶封片，光学显微镜下观察。阴性对照用0.01 mol/L PBS（pH 7.5）代替一抗。

1.3.5免疫组化结果判读P-JAK2以胞浆中出现背景清晰的棕黄或棕褐色颗粒为阳性，P-STAT3以细胞核或胞浆中出现背景清晰的棕黄或棕褐色颗粒为阳性，突变型p53以细胞核中出现背景清晰的棕黄或棕褐色颗粒为阳性。由2名经验丰富的病理科医生双盲独立判定结果，若初步诊断不一致，经两者共同讨论决定，若仍未能达成一致意见，则请第3名医师参与，讨论得出一致结论。每例切片选取任意10个400倍视野进行观察，按染色强度及阳性细胞数百分比综合计分。染色强度:不着色计0分，淡黄色1分，棕黄色计为2分，棕褐色计3分；阳性细胞百分比:0～5%计0分，6%～20%计1分，21%～50%计2分，50%以上计3分。将染色强度与阳性细胞百分比得分相乘，0分为阴性(-)，1～3分为弱阳性(+), 4～5分为中度阳性(++)，≥6分为强阳性(+++)。

1.4统计学方法数据用SPSS 17.0软件进行分析，计量资料以x ±s表示，组间比较用F检验，组间多重比较用SNK-q检验。计数资料用例（%）表示，组间比较采用χ2检验，相关分析采用Spearman相关。检验水准α=0.05,χ2检验两两比较时采用卡方分割法，并相应校正检验水准。

2　结果

2.1HR-HPV感染检测结果测得HR-HPV基因型主要有：HPV16、18、31、33、35、39、45、52、56、58、68、73、82型。SCC组的HR-HPV感染率高于其他3组，HSIL组高于LSIL组和NC组(P＜0.008 3)，LSIL组与NC组间差异无统计学意义，见表1。

2.2P-JAK2蛋白在各组中的表达及其与SCC临床病理特征的关系SCC组的P-JAK2阳性表达率高于其他3组，HSIL组、LSIL组高于NC组，HSIL组与LSIL组差异无统计学意义，见表1。P-JAK2蛋白在SCC组中的表达情况：临床分期Ⅲ～Ⅳ期高于Ⅰ～Ⅱ期，组织学分级Ⅱ、Ⅲ级高于Ⅰ级，有淋巴结转移者高于无淋巴结转移者，有HR-HPV感染者高于无HRHPV感染者，差异均有统计学意义，见图1、表2。

Tab. 1 Comparison of P-JAK2, P-STAT3 and mutant p53 expression and HR-HPV infection between four groups表1　各组P-JAK2、P-STAT3、突变型p53及HR-HPV感染比较　例（%）

Fig. 1 Expression of P-JAK2 in cervical tissue in four groups (SP，×400)图1　各组宫颈组织中P-JAK2表达情况(SP，×400)

2.3P-STAT3蛋白在各组中的表达及其与SCC临床病理特征的关系SCC组的P-STAT3阳性表达率高于LSIL组及NC组，与HSIL组差异无统计学意义。HSIL组高于NC组，LSIL组高于NC组，HSIL组与LSIL组差异无统计学意义，见表1。P-STAT3蛋白在SCC组中的表达情况：临床分期Ⅲ～Ⅳ期高于Ⅰ～Ⅱ期，组织学分级Ⅲ级高于Ⅰ级；有淋巴结转移者高于无淋巴结转移者，有HR-HPV感染者高于无HR-HPV感染者，差异均有统计学意义，见表2、图2。

2.4突变型p53在各组中的表达及其与SCC临床病理特征的关系SCC组、HSIL组的突变型p53阳性表达率显著高于LSIL组、NC组，HSIL组与SCC组、LSIL组与NC组差异无统计学意义。突变型p53蛋白在SCC组中的表达情况：临床分期Ⅲ～Ⅳ期高于Ⅰ～Ⅱ期，有淋巴结转移者高于无淋巴结转移者，有HR-HPV感染者高于无HR-HPV感染者，差异均有统计学意义，见表2、图3。

Tab. 2 Relationship between P-JAK2，P-STAT3, mutant p53 expression and different clinical-pathological characteristics of squamous carcinoma of the cervix表2　不同临床病理资料宫颈鳞癌患者的P-JAK2、P-STAT3、突变型p53表达情况比较

Fig. 2 Expression of P-STAT3 in cervical tissue in four groups (SP，×400)图2　各组宫颈组织中P-STAT3表达情况(SP，×400)

2.5SCC组P-JAK2、P-STAT3、突变型p53蛋白表达及HR-HPV感染之间的相关性P-JAK2与PSTAT3、突变型p53及HR-HPV感染均呈正相关，见表3。P-STAT3蛋白与突变型p53蛋白、HR-HPV感染呈正相关，见表4。突变型p53蛋白表HR-HPV感染呈正相关，见表5。

Fig. 3 Expression of mutant p53 in cervical tissue in four groups (SP，×400)图3　各组宫颈组织中突变型p53表达(SP，×400)

Tab. 3 The association of P-JAK2 expression with the expression of P-STAT3，mutant p53 and HR-HPV infection in SCC group表3　P-JAK2与P-STAT3、突变型p53、HR-HPV 在SCC组中表达的相关性

Tab. 4 The association of P-STAT3 expression with the expression of mutant p53 and HR-HPV infection in SCC group表4　P-STAT3与突变型p53、HR-HPV在SCC组中表达的相关性

Tab. 5 The association of mutant p53 expression with the HR-HPV infection in SCC group表5　突变型p53与HR-HPV感染在SCC组表达的相关性

3　讨论

3.1HR-HPV与宫颈病变的关系HR-HPV感染是引发宫颈病变的重要因素。女性初次感染HPV后，可在大约8个月内通过自身免疫力清除，若持续感染HR-HPV超过1～2年，有进展为癌前病变或浸润癌的风险[5]。An等[6]研究发现，在正常宫颈、LSIL、HSIL、宫颈癌中，HR-HPV病毒的清除率分别是56.8%、14.8%、0.2%、0，说明随着宫颈病变的进展，HPV感染患者清除病毒的能力显著降低。李洪林等[1]研究发现，正常宫颈组的HR-HPV感染率显著低于CINⅡ级、CINⅢ级及宫颈癌组，与CINⅠ组无明显差异，其认为HR-HPV感染多存在于高级别上皮内瘤变及癌变组织中，是促进宫颈癌前病变向癌变发展的重要因素。本实验发现SCC中的HRHPV感染率显著高于NC组、LSIL组及HSIL组，LSIL组与NC组之间无明显差异，提示LSIL病变之前的病毒感染是可逆的，当病毒的DNA整合入宿主基因组时，会导致持续感染，从而促进宫颈病变恶化。

3.2P-JAK2、P-STAT3及突变型p53与宫颈病变的关系JAK-STAT是一条由细胞因子刺激的信号转导通路，参与细胞增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程，JAK2及STAT3是这条通路上重要的成员[2,7]。JAK2激活后，酪氨酸残基磷酸化，招募含有SH2结构域的STAT3蛋白，STAT3 在Y705、Ser727、Lys685位点磷酸化，进一步入核调控下游靶基因表达，参与细胞凋亡、增殖、血管形成等过程，这在多种肿瘤研究中已经得到证实[2，8-10]。Xu等[11]通过系统分析发现非小细胞型肺癌中PSTAT3表达与肺癌分期、分化、淋巴转移及预后有关。Shukla等[12]发现宫颈癌中持续激活的STAT3表达明显高于癌前病变，与宫颈癌的不良预后有关。Sobti等[13]发现，宫颈癌组织中的STAT3 mRNA表达显著高于正常宫颈组织及癌前病变组织，且癌组织中的STAT3 mRNA表达与临床分期有关，其认为持续激活的STAT3可能通过调控Bcl-xL、Mcl-l、Bcl-2、Myc及细胞周期蛋白D1促进细胞恶性增殖，参与肿瘤进展。本研究结果显示，P-JAK2在SCC中的阳性表达率显著高于SIL组及NC组，且LSIL组及HSIL组均显著高于NC组，表明P-JAK2表达发生于宫颈病变早期。SCC中的P-STAT3阳性表达率明显高于LSIL组及NC组，SCC组与HSIL组无明显差异，表明与P-JAK2相比，P-STAT3发挥作用较晚，可能主要发生于宫颈高级别病变时期。大量研究证实HPV病毒编码的早期癌蛋白E6/E7是病毒感染导致宫颈癌变的重要因素，两者分别抑制抑癌基因p53及Rb基因表达。突变型p53基因在多种恶性肿瘤中异常表达，可促使细胞恶性增殖[14]。本实验发现突变型p53蛋白在SCC组中的阳性表达率显著高于LSIL组及NC组，P-JAK2/P-STAT3及突变型p53表达在FIGO晚期（Ⅲ～Ⅳ）及伴有HRHPV感染的SCC组织中的阳性表达率高于FIGO早期（Ⅰ～Ⅱ）及病毒感染阴性的SCC组织，提示PJAK2/P-STAT3及突变型p53可能促进宫颈病变的进展。

3.3P-JAK2/P-STAT3、突变型p53与HR-HPV的关系JAK2磷酸化后，作用于STAT3，已在多种肿瘤中证实。Shukla等[12]发现P-STAT3蛋白表达与HPV感染有关，在HPV+细胞系中，P-STAT3表达显著高于HPV-细胞系，认为STAT3表达及磷酸化可能与HPV感染形成及持续感染有关。Shukla等[4]研究发现，STAT3与HPV E6癌基因表达呈正相关，与野生型p53表达呈负相关，他们利用siRNA或AG490（阻滞STAT3的酪氨酸磷酸化）测得野生型p53的表达呈现剂量依赖性增加、E6表达下降、癌细胞生存能力下降，这在HPV感染的细胞系中表现尤为明显，认为STAT3可以促进HPV病毒的致癌基因表达，促进病毒导致的宫颈病变进展，因此，抑制STAT3活化可能成为靶向治疗宫颈癌的新方法。Niu等[10]在乳腺癌研究中得知，STAT3可抑制野生型p53表达，两者表达呈负相关，然而突变后的p53失去STAT3的抑制位点，突变型p53可促进STAT3对细胞的恶性增殖作用。本研究显示，随着宫颈病变进展，P-JAK2、P-STAT3及突变型p53表达，HR-HPV感染率上调，且两两之间的阳性表达呈正相关，说明这四者在宫颈鳞癌形成、进展中可能有直接或间接的协同作用，检测这4种因子可增加宫颈鳞癌诊断的准确性，可作为判断宫颈鳞癌预后的指标。

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（2015-08-03收稿2015-09-23修回）

（本文编辑闫娟）

作者单位：天津医科大学第二医院妇科（邮编300211）

Expression and clinicopathological significance of P-JAK2, P-STAT3 and mutant p53 proteins in cervical lesions

MA Hui1，YIN Lirong1△，WANG Fang2，LI Honglin2，SHAN Shu2
Department of Gynecology, The Second Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300211, China
△CorrespondingAuthor E-mail:yinlirongfk@sina.com

Abstract:Objective To investigate the expression and prognostic significance of P-JAK2, P-STAT3 and mutant p53 in cervical lesions. Methods A total of 153 cervical biopsies of patients from Gynecology Department, The Second Hospital of Tianjin Medical University were recruited during December 2013 to June 2015. Fifty-seven cases of squamous carcinoma of cervix (SCC), 36 cases of low grade intraepithelial neoplasia (LSIL), 30 patients with high grade intraepithelial neoplasia (HSIL) and 30 cases of normal cervix (NC) were included in the study. Gene chip method was used to detect high-risk hu⁃man papillpmavirus（HR-HPV）infection. Hematoxylin-eosin staining was used to make pathological diagnosis. Immunohis⁃tochemical assay was used for the detection of P-JAK2, P-STAT3 and mutant type p53 protein expression in cervical le⁃sions. Results (1) HR-HPV infection rate and P-JAK2 expression were significantly higher in SCC group than those of HSIL group, LSIL group and NC group (P < 0.05). (2) The expression of P-STAT3 and mutant type p53 were significantly higher in SCC group than those of LSIL group and NC group (P＜0.05). However, there was no significant difference between SCC group and HSIL group. (3) The positive expressions of P-JAK2 and P-STAT3 showed significant differences in different FIGO stages, histopathological grade, lymph node metastasis and HR-HPV infection in SCC group, respectively (P < 0.05). There were significant differences in the positive expression of mutant type p53 between different FIGO stages and HR-HPV infection (P＜0.05). (4) There was positive correlation between P-JAK2, P-STAT3, positive expression of mutant type p53 and HR-HPV infection in SCC tissues (P＜0.05). There was a positive correlation between P-STAT3, p53 expression and HR-HPV infection (P < 0.05). There was a positive correlation between mutant p53 expression and HR-HPV infection (P < 0.05). Conclusion P-JAK2, P-STAT3 and mutant p53 protein expression rates are high in SCC group than those of NC and SIL groups, which may be associated with HR-HPV infection, cervical cancer occurrence and progression.

Key words：phosphorylated Janus kinase 2; phosphorylated signal transduction and transcription factor 3; mutant p53; squamous carcinoma of the cervix; high-risk human papillpmavirus; squamous intraepithelial lesion；immunohistochemistry

中图分类号：R711.74

文献标志码：A

DOI:10.11958/20150047

作者简介：马慧（1989），女，硕士研究生在读，主要专注宫颈癌发病机制研究