血清淀粉样蛋白A诱导中性粒细胞胞外诱捕网形成

苏慧慧，万春友，魏蔚，孟海妹，焦亚冲，邢冬红，郑芳△



血清淀粉样蛋白A诱导中性粒细胞胞外诱捕网形成

苏慧慧1，万春友2，魏蔚3，孟海妹1，焦亚冲1，邢冬红1，郑芳1△

摘要：目的探究血清淀粉样蛋白A（SAA）能否在体外诱导中性粒细胞形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）。方法建立稳定的体外诱导NETs形成方法，包括外周血中性粒细胞的分离、细胞体外培养、NETs的诱导和形态学观察。提取健康志愿者的外周血中性粒细胞，分为阴性对照（NC）组、SAA组和脂多糖（LPS）组，给予相应的刺激后，观察NETs的形成并计算百分率，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测培养上清中人组蛋白3（h3）的含量。结果提取的外周血中性粒细胞纯度与细胞活力均在95%以上。显微镜下观察到部分细胞的细胞核失去原有核型，向外扩散形成网状，即NETs。与NC组相比，接受SAA刺激的中性粒细胞有更多的NETs形成（P < 0.05）。培养液上清中的h3含量显著高于NC组（P < 0.05）。结论SAA可在体外诱导中性粒细胞形成NETs。

关键词：血清淀粉样蛋白A；中性粒细胞胞外诱捕网；中性粒细胞；炎症；人组蛋白3

△通讯作者E-mail：zhengfang@tijmu.edu.cn

中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs）是中性粒细胞受到相应刺激时形成的以DNA为骨架，颗粒蛋白等黏附其上的网状结构[1]。NETs形成后可限制感染的扩散，有免疫防御的功能[1]。此外，NETs还参与炎症过程和一些自身免疫病的发生与发展[2]。血清淀粉样蛋白A（serum amyloid A，SAA）是一种主要的急性时相反应蛋白，在一些炎症性疾病中表达水平可大幅度升高。SAA作用于中性粒细胞，可趋化其向炎症部位聚集，并诱导中性粒细胞表达多种细胞因子[3]。但SAA与中性粒细胞形成NETs这一过程的关系目前尚鲜见报道。本研究旨在探究SAA是否能够诱发中性粒细胞形成NETs这一过程。

1　材料与方法

1.1材料Histopaque- 1119、Histopaque- 1077、脂多糖（LPS）均购于Sigma-Aldrich（德国）公司。重组人Apo-SAA购于peprotech（美国）公司。人组蛋白3（histone 3，h3）酶联免疫试剂盒购于鑫乐（中国，上海）公司。无酚红1640购于康宁公司。DAPI染料、红细胞裂解液购于solarbio（中国）公司。

1.2方法

1.2.1中性粒细胞的分离选取4名2015年3—4月到天津医科大学总医院进行健康体检的健康志愿者，清晨空腹采集静脉血，EDTA抗凝，按如下步骤分离中性粒细胞。EDTA抗凝全血、Histopaque-1119、Histopaque-1077按2∶1∶1的比例加入离心管。首先加入3 mL Histopaque-1119，再将3 mL Histopaque-1077加于其上避免晃动，然后加入EDTA抗凝全血6 mL。700×g离心30 min低速制动。离心后His⁃topaque-1119及Histopaque-1077之间的细胞层为中性粒细胞。收集中性粒细胞，加入红细胞裂解液1 mL，室温裂解2 min，450×g离心3 min，加入PBS重悬，450×g离心3 min，如此洗2遍。加入无血清无酚红的1640培养基重悬细胞，计数并将细胞稀释至所需密度备用。4 g/L台盼蓝染色后观察细胞活力。HE染色观察（×400），随机取10个视野并分类计数视野中全部细胞，计算中性粒细胞百分率。DAPI染色观察细胞核形态。

1.2.2NETs的诱导提取中性粒细胞，血细胞计数板计数细胞个数。将细胞密度调至1.5×105个/孔，接种于铺有盖玻片的24孔板，置于含有5%CO2、37℃的细胞培养箱中培养30 min。实验分为3组：SAA组加入SAA，终浓度为25 mg/L（基于之前预实验的结果）；阴性对照（NC）组加入等体积的Tris-HCL缓冲液作溶剂对照；LPS组加入LPS，终浓度为1 mg/L。每组样本各设3个复孔。4 h后收集上清，350×g离心5 min，留取上清，存于-20℃备用。孔中加入4%多聚甲醛固定细胞爬片10 min，用于后续研究。

1.2.3NETs的观察与评估细胞爬片固定后，0.01 mol/L PBS浸洗3次，每次5 min。之后0.05% trition通透1 min，0.5 mg/L DAPI染液避光染色5 min，0.01 mol/L PBS浸洗3次，甘油与水1∶1比例配置的封片液封片，荧光显微镜观察。每个细胞爬片随机计数10个视野中的NETs数和细胞总数，计算NETs形成百分率。

1.2.4细胞培养液上清中h3含量的检测将样本用稀释液稀释4倍后，按说明书上标明的程序，采用ELISA法检测细胞培养液上清中h3含量。

1.3统计学方法采用SPSS 17.0软件分析数据，作图采用GraphPad Prism 5软件，计量资料采用±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用Dunnett-t检验，检验水准为双侧α=0.05。

2　结果

2.1中性粒细胞的提取镜下可见中性粒细胞占所提取细胞总数的95%以上，见图1 A。DAPI染色显示细胞核为典型的分叶核，胞核边界清晰可见，没有模糊扩散等现象，见图1 B。台盼蓝染色鉴定细胞活力显示，细胞活力在98%以上，提示该提取方法切实可行。

2.2SAA体外诱导NETs形成

2.2.1各组NETs形成情况比较部分中性粒细胞细胞核失去原有的分叶形态，胞核边界消失变得模糊，细胞核向外扩散，即形成NETs，见图2。且SAA组与LPS组形成NETs的细胞数占总细胞数的百分率显著高于NC组（P < 0.05）。提示SAA可促使中性粒细胞形成NETs，见图3。

Fig. 1 Picture showing purified neutrophils图1　提纯的中性粒细胞

Fig. 2 Morphologic observation of neutrophils exposed to stimulants图2　中性粒细胞被诱导后的形态学观察（DAPI，×200）

Fig. 3 Comparison of percentages of NETs neutrophils between three groups图3　各组形成NETs的细胞数占总细胞数的百分率比较

2.2.2各组细胞培养液上清中h3含量比较SAA组与LPS组细胞培养液上清中h3的含量高于NC组（P < 0.05）。说明SAA组比NC组有更多的细胞形成NETs，见图4。

Fig. 4 Comparison of concentrations of h3 in supernatant between three groups图4　各组细胞培养液上清中h3含量比较

3　讨论

3.1NETs、SAA与炎症自2004年NETs被首次报道[1]后，有关NET的研究取得了较快进展。研究显示NETs除参与生理性的免疫防御外，还与多种炎症相关疾病的病理过程密切相关。如系统性红斑狼疮（SLE）、类风湿关节炎（RA）、微小血管炎以及癌症[2,4]等疾病中均有NETs的参与。SAA作为一种急性时相反应蛋白，在各种炎症疾病中多有表达水平的升高，且发挥着复杂的免疫调节作用[5]。在一些感染性疾病和慢性炎症性疾病如败血症[6-7]和类风湿关节炎[2,8]中，可见SAA表达量和NETs形成量同时升高。提示SAA与NETs的形成之间可能有一定程度的相关。

3.2培养液上清中h3的含量与NETs的形成h3是一种核蛋白，正常情况下存在于细胞核内。在NETs形成过程中，由于细胞膜及核膜的破裂，h3可进入培养液。因此培养液中的h3含量可以在很大程度上反映NETs的形成量。在分析ELISA与形态学计数的百分率结果时发现，二者的结果相一致，即不管是细胞培养液中h3的含量还是形成NETs细胞的百分率，SAA组与LPS组均显著高于NC组。但是ELISA结果相较于百分率结果整体数值略高，可能由于实验处理过程中不可避免有细胞损伤和胞膜破裂，致使h3的含量升高；另外NETs形成后随时间推移可能会有扩散或分解。

3.3SAA与NETs的形成本研究显示，SAA组与LPS组形成NETs细胞的百分率和细胞培养上清中h3的含量显著高于NC组，提示SAA能够诱导中性粒细胞形成NETs。之前的研究表明LPS能够诱导中性粒细胞形成NETs[9]，这与本实验结果相一致，说明本研究的实验方法可靠。关于SAA与NETs形成之间的关系，目前尚鲜见相关报道。但是近来研究显示SAA可诱导中性粒细胞产生活性氧簇（reac⁃tive oxygen species，ROS）[10]，而ROS的生成是NETs形成过程中的关键步骤。有研究指出，ROS可直接诱导中性粒细胞形成NETs[11]；在抑制与ROS生成相关的NADPH氧化酶和髓过氧化物酶后，NETs的形成受到抑制[11-12]。上述研究成果间接支持了本研究的结论，同时提示SAA或许经诱导ROS的产生，进一步诱发中性粒细胞形成NETs这一过程。

综上，本研究结果提示SAA能够在体外诱导中性粒细胞形成NETs。在体内环境中SAA也可能通过相似的机制影响免疫反应的进程。中性粒细胞形成NETs是一种新发现的重要的免疫过程。研究其与SAA之间的相互作用关系有助于进一步认识机体的免疫反应和相关疾病的病理机制。

参考文献

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（2015-10-19收稿2015-11-01修回）

（本文编辑李鹏）

作者单位：1天津医科大学医学检验学院免疫学教研室（邮编300203）；2天津市天津医院；3天津医科大学总医院

Serum amyloid A induces the formation of NETs

SU Huihui1, WAN Chunyou2, WEI Wei3, MENG Haimei1, JIAO Yachong1, XING Donghong, ZHENG Fang1△
1 Department of Immunology, School of Laboratory Medicine, Tianjin Medical University, Tianjin 300203, China; 2 Tianjin Hospital; 3 General Hospital of Tianjin Medical University
△Corresponding Author E-mail: zhengfang@tijmu.edu.cn

Abstract：Objective To explore whether serum amyloid A (SAA) can induce the formation of neutrophil extracellular traps（NETs）in neutrophils in vitro. Methods A stable method for inducing NETs formation in vitro was established, in⁃cluding isolation of peripheral blood neutrophils, cell culture, and NETs formation and observation. The neutrophils were iso⁃lated from peripheral blood of healthy volunteers. And cells were cultured in vitro and classified into three groups: negative control (NC) group, SAA group and lipopolysaccharide (LPS) group. Following the distinct stimulation in three groups, NETs formation was observed and its percentage was calculated. The concentration of hinstone (h) 3 in supernatant was detected by ELISA. Results The purification and vitality of isolated neutrophils were both more than 95%. The nuclei of neutrophils lost their shape and spread, NETs formation was found. More NETs formation was found in SAA group than that in NC group (P < 0.05). Moreover, the concentration of h3 in supernatant was significantly higher in SAA group than that in NC group (P < 0.05). Conclusion SAA can induce the formation of NETs in vitro.

Key words：serum amyloid A protein；neutrophil extracellular traps; neutrophil；inflammation；hinstone 3

中图分类号：R392.11

文献标志码：A

DOI:10.11958/20150240

基金项目：天津市应用基础与前沿技术研究计划项目（14JCYBJC25600）

作者简介：苏慧慧（1990），女，硕士在读，主要从事中性粒细胞胞外诱捕网与类风湿关节炎相关研究