微卫星DNA标记应用前景浅议

冯钦

摘 要 微卫星广泛存在于真核生物基因组中，一般由1～6个碱基组成重复片段，因为其种类多、分布广及重复次数在个体间具有高度的变异性呈现高度的多态性、共显性，所以微卫星DNA标记已经成为种群遗传学中被广泛应用的分子标记。就微卫星的结构、功能及其形成机制方面在特定基因定位，种群遗传结构分析、种群内亲缘关系界定、物种进化分析等方面的应用进行阐述。

关键词 微卫星；物种进化；基因图谱；亲子鉴定

中图分类号：S852.2 文献标志码：B 文章编号：1673-890X（2016）01--02

分子标记是以个体之间的遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平上遗传多态性的直接的反映。微卫星标记是继RFLP、AFLP之后的一种新的遗传标记。微卫星标记已被广泛应用于保护遗传学研究的各个领域，包括种群遗传多样性评估、种群遗传结构分析、遗传图谱构建、基因定位和亲子鉴定等。

1 微卫星标记的发现

20世纪70年代，生物科学家Litt[1]等在研究寄居蟹基因组DNA时发现其基因组中存在许多不同碱基的重复序列。在后续研究中，发现人、动物和酵母基因组中均存在大量类似的重复单元并于1988年将此重复序列作为新的遗传标记并应用于人类，创造出“微卫星”（Microsatellite）的名称。

2 微卫星的结构

微卫星又称简单重复系列（Simple Sequence Repeats，SSR）或简单串联重复序列多態性（Short Tandem Repeat Polymorphism，STRP），这些位点由短的重复串联序列（1～6 bp）组成。这些微卫星序列广泛分布于基因组中，其重复次数以及重复程度在不同生物及个体之间呈现高度多态性。依据微卫星核心序列的排列方式将微卫星分为3大类，完全重复（无间隔），不完全重复（间隔序列存在于重复单元中）和复合型（2个以上重复单元）。

3 微卫星的筛选

目前，获得微卫星DNA的方法有3种。一是通过构建基因组文库，标记核心重复序列作为探针，与基因组文库进行杂交筛选，然后测序进而设计特异性引物等步骤；二是利用近缘物种DNA序列的同源关系，通过已知的微卫星引物跨种使用，进而筛选到适合新物种的微卫星DNA标记；三是利用高通量测序，构建文库，利用生物信息学知识进行大面积筛选。目前，随着基因组计划的全面展开，三大DNA数据库Genebank、EMBL、DDJB收录的数据越来越多，通过检索比对将更容易获取更多的微卫星标记。

4 微卫星的特点

微卫星DNA遵循孟德尔遗传，呈共显性，在基因组中分布广、多态性高，实验操作简单，结果稳定可靠等优点，有效克服了RAPD、AFLP等标记的随机性，即不同位点但大小相同的等位基因，所以微卫星成为分析生物群体遗传结构与变异的理想分子标记。微卫星呈现多态性，主要体现在其核心序列的重复数的多态性以及等位基因位点的多态性。研究结果表明，微卫星重复单元重复次数越多，其等位基因的数目也越多。微卫星的突变率较高，在不同物种及个体之间的相同位点的不同等位基因和不同位点之间均存在较大的多态性。

微卫星DNA标记符合孟德尔遗传，遗传信息从上一代传递到下一代，并呈共显性，每个位点存在多个等位基因且具备较高的多态性，降低了自然选择对其的影响，且其结果稳定可靠。一系列不同微卫星位点的等位基因数据，可以显示遗传重组事件和基因型关系，进而推算种群间的遗传交流。因此，微卫星DNA标记被广泛应用于物种进化和种群结构等方面。

5 微卫星的应用

5.1 群体遗传结构分析

微卫星呈现共显性，属于单位点遗传标记。每个微卫星位点存在多个等位基因，具有较高的杂合度，对于自然选择的影响较小，因此微卫星标记非常适合研究种群变异。England[2]等利用8个微卫星位点对黑尾果蝇群体进行检测，发现微卫星比同工酶具有更高的多态性。Machugh[3]等利用25个微卫星位点对39个不同品系的欧洲牛进行分析，计算其个体之间的遗传距离并构建遗传图谱，图谱显示与已知的遗传背景接近。微卫星NA标记，基于其位点的不同等位基因及杂合性，在分析种群间的遗传结构都表现了高度的有效性。

5.2 物种进化和系统发生

微卫星的多态性可以反映物种的进化历程，物种的分化速度及遗传距离，基于此推断物种的系统进化与演变。Estoup[4]等利用7个微卫星引物对7个西方蜜蜂群（3个非洲、4个欧洲）进行分析，表明西方蜜蜂是由3个亲缘较远的蜜蜂群进化而来。而Franck[5]则利用8微卫星位点分析埃及蜜蜂，表明埃及蜜蜂来源于西方蜜蜂，进一步研究意大利和西西里蜜蜂之间的遗传差异，从而阐明了两者的起源与进化。

5.3 遗传多样性与物种资源保护

物种灭绝消失，其遗传信息也将随之而去，导致自然界的遗传多样性降低。因此，遗传多样性与保护已经成为生物多样性研究的主要内容。微卫星成多态性，统计不同位点的等位基因数目和频率，进而分析物种种群的遗传结构，评估其遗传多样性；同时，计算不同品种之间的遗传变异关系。选择有效基因，并对有效基因在世代过程中的传递进行跟踪，有意识的进行选种，防止有效基因因为遗传票变而丢失，进而提出可靠合理的遗传保护措施[6]。目前，针对濒危野生动物，应当建立个体遗传档案，有意识的制定繁殖进化，防止近亲交配，导致物种衰退。

5.4 亲缘关系鉴定

微卫星位点多态性高，每个位点存在多个等位基因，并且遵循孟德尔遗传规律，呈显性，遗传信息稳定的进行世代传递。微卫星在个体之间具有高度的个体专一性和多态性，基于以多个位点在一定的群体中计算等位基因的频率从而推断血缘鉴定。目前，随着对动物个体及其品质的要求越来越高，明确的谱系在育种过程中是非常必要的。大熊猫属于一雌多雄的生殖方式，利用微卫星张亚平等成功的对其家系进行了验证[7]。

6 微卫星的相关问题

目前，微卫星标记被广泛应用于生物种群遗传学、种群生态学、亲子鉴定等领域，但是该技术也受到一些其他方面因素的制约。一是微卫星的筛选，检测及鉴定；二是对于非损伤性获取样品进行检测也存在一定的困难；三是PCR引物在不同物种间的保守性不高，需要针对不同物种设计特异性引物；四是引物扩增可能出现无效等位基因，导致结果无法使用。同时，仍有很多有关微卫星的研究尚在探索中，如微卫星的功能、三碱基重复序列的不稳定性的分子机理，以及微卫星突变导致的疾病机理。

参考文献

[1]Litt M ， Luty J A. A Hypervariable Microsatellite Revealed by In Vitro Amplification of A Dinucleotide Repeat within the Cardiac Muscle Actin Gene[J].American Journal of Human Genetics，1989，44（3）.

[2] England P R， Briscoe D R. Microsatellite pPolymorphisms in aA wWild pPopulation of Drosophila mMelanogaster.[J]. Genetics Research， 1996， 67（3）：285-290.

[3] Machugh D E， Shriver M D， Loftus R T， et al. Microsatellite DNA vVariation and the eEvolution， dDomestication and pPhylogeography of tTaurine and zZebu cCattle （Bos taurus and Bos indicus）.[J]. Genetics， 1997， 146（3）：1071-1086.

[4] Estoup A， Garnery L. Microsatellite vVariation in hHoney bBee （Apis mellifera l.） pPopulations： Hierarchical genetic[J]. Genetics， 1995（7）.

[5] Franck P， Garnery L， Solignac M， et al. Molecular cConfirmation of aA fFourth lLineage in hHoney bBees from the Near East[J]. Apidologie， 2000， 31（2）：167-180.

[6]黄磊，王义权.微衛星分子标记在濒危动物保护遗传学研究中的应用[J].生物多样性，2004（5）.

[7]高焕，孔杰，于飞，等.人工控制自然交尾条件下中国对虾父本的微卫星识别[J].海洋水产研究，2007，28（1）.

（责任编辑：赵中正）