长期继代蝴蝶兰类原球茎对抗氧化剂的生理响应及DNA稳定性分析

刘福平　陈淳　林志楷

摘 要 为了解抗氧化剂减缓长期继代蝴蝶兰类原球茎衰老的机理，本实验在培养基添加抗氧化剂100 mg/L半胱氨酸和8 g/L甘露醇继代类原球茎24个月，分析其相关氧化指标及DNA稳定性。结果表明，类原球茎培养期间处理组总活性氧水平变化趋势与对照组不同，处理组比对照组低，对照组总活性氧水平消长趋势与超氧阴离子（O2·- ）生成速率较为一致，处理组则与羟自由基（·OH）相对含量的消长趋势较一致。继代期间丙二醛含量变化趋势与总活性氧水平变化趋势相似，处理组比对照组低。类原球茎DNA的SRAP分析结果表明，继代培养期间处理组与对照组间均未发生明显的DNA差异。类原球茎DNA甲基化程度变化趋势与总活性氧水平变化大体相同，中后期处理组比对照组低。

关键词 蝴蝶兰；类原球茎；长期继代；抗氧化剂；氧化指标；DNA稳定性

中图分类号 S682.31 文献标识码 A

Abstract To understand the mechanism that antioxidants slowed down the aging of Phalaenopsis PLB through long-term subculture， PLB were subcultured for 24 months in the culture supplemented with antioxidants（100 mg/L cysteine and 8 g/L mannitol）， and the related oxidant indexes and DNA stability of PLB were analyzed in the experiment. The results showed that during subculturing of PLB the variation tendency of levels of total reactive oxygen species（T-ROS）was not consistent between the control and the treatment. The T-ROS levels of the treatment were lower than that of the control. During PLB subculturing， the variation tendency of the levels of T-ROS in the control was consistent with that of the growth rate of superoxide anion（O2·- ）， but it accorded with the relative quantity of hydroxyl radical（·OH）in the treatment. The changes of malondialdehyde content were generally consistent with the levels of T-ROS during subculturing， the contents were lower in the treatment than that in the control. The result of SRAP analysis on genome DNA indicated the polymorphic difference did not show clearly in the PLB throughout subculturing， as well as between the control and the treatment. The variation tendencies of levels of DNA methylation of PLB and the levels of T-ROS were about the same. However， the levels in the treatment were lower than that in the control at middle-late stage.

Key words Phalaenopsis spp.； PLB； Long-term subculture； Antioxidants；Oxidant index；DNA stability

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.01.015

植物組培的中间繁殖体（愈伤组织等）随着继代培养时间延长，其增殖、分化能力逐渐降低已有许多报道[1]。类原球茎（PLB）是兰科植物组培的主要中间繁殖体，其长期继代培养的研究已有少量报道，如采用无激素培养基有利于蝴蝶兰（Phalaenopsis spp.）某些品种类原球茎长期继代，其分化的植株表观性状稳定[2-3]，分别调节培养基激素及糖浓度有利于长期继代的春石斛类原球茎增殖和生根[4]，长期继代培养物的变异近年来主要采用分子标记检测，如春兰克隆繁殖苗[5]，铁皮石斛丛芽扩繁的分生苗[6]、霍山石斛愈伤组织[7]、霍山石斛类原球茎[8]等。

笔者以常规方法继代培养蝴蝶兰类原球茎24个月，增殖和分化能力有所降低，在培养基添加100 mg/L半胱氨酸与8 g/L甘露醇组合的抗氧化剂处理，虽然继代培养后增殖和分化能力也有所降低，但比对照（常规培养基）类原球茎增殖能力显著提高，萌发率极显著提高。关于植物组培中长期继代中间繁殖体的衰老或退化现象，普遍认为是活性氧自由基致酶失活，影响生理代谢，启动膜脂过氧化连锁反应、破坏核酸结构等所致[9-10]，即自由基在植物生理衰老和遗传变异上均有重要的效应。笔者研究在培养基添加抗氧化剂长期继代蝴蝶兰类原球茎的相关氧化指标和DNA稳定性变化，以初步了解抗氧化剂减轻类原球茎衰老的生理及分子机理。

1 材料与方法

1.1 材料

蝴蝶兰瓶苗（YZ45）由福建省亚热带植物研究所组培室提供。以嫩叶切块为外植体，诱导培养基为1/2MS+6-BA 8 mg/L+CW（椰子汁）20%（V/V）+ 蔗糖2%（W/V），诱导出的PLB转接到1/2MS+6-BA 3 mg/L+CW 20%（V/V）+蔗糖2%（W/V）培养基扩繁，获得大量PLB作为实验材料。培养条件均为光照1 500 lx，12 h/d，温度24～26 ℃。

1.2 方法

1.2.1 类原球茎长期继代方法 将PLB接种于继代培养基1/2MS+CW 20%（V/V）+蔗糖2%（W/V），每瓶鲜重3.00 g，培养2个月，随机取9瓶称量每瓶PLB鲜重，作为增殖能力指标。将PLB团剥离出中等大小单粒PLB，接种到分化培养基1/2MS+6-BA 3 mg/L+CW 20%（V/V）+NAA 0.5 mg/L+蔗糖2%（W/V），每瓶接种10粒，培养2个月（以上培养条件均同1.1），随机取9瓶观测颜色变化，PLB存活率为仍呈绿色的PLB数/总PLB数×100%，分化率为出芽长根PLB数/总PLB数×100%。

PLB长期继代培养方法，对照组为上述继代培养基配方，处理组为对照组培养基添加抗氧化剂半胱氨酸100 mg/L培养基和甘露醇8 g/L培养基。每瓶接种PLB起始鲜重3.00 g，每 2 个月继代分瓶1次。在培养的第8、16、24个月，检验PLB增殖能力，方法为每处理取PLB鲜重3.00 g接种于继代基本培养基，培养2个月（以上培养条件均同1.1）每处理随机取9瓶观测每瓶PLB鲜重，PLB成活率和分化率观测计算方法同上。

取培养的第0、8、16、24个月PLB进行生理生化指标、DNA稳定性分析。

1.2.2 生理指标分析

（1）總活性氧（T-ROS）水平。ELISA检测试剂盒由上海博舜生物科技有限公司提供，取0.5 g鲜PLB于500 μL生理盐水研磨，其他按说明书操作，450 nm处测吸光值。标准曲线y=771.3x-41.21（R2=0.991），活性氧水平以U/mL表示。

（2）羟自由基（·OH）相对含量。按刘福平等[11]介绍的方法。以单位时间每克鲜重在420 nm处的吸光度变化为单位， 即ΔA420/（min·g FW）。

（3）超氧阴离子（O2·- ）生成速率。参照汤章成[12]的方法，同时做NO2-标准曲线，得y= 48.539 1x+1.170 3（R2=0.998 2），结果以μmol/（min·g FW）表示。

（4）过氧化氢（H2O2）含量。按宋松泉等[13]及沈文飚等[14]介绍的方法， 同时做H2O2标准曲线，得y=1 426.5x+0.357 2（R2=0.996），结果以μmol/g FW 表示。

（5）丙二醛（MDA）含量。按汤章成的方法[12]，结果以μmol/g FW表示。

1.2.3 DNA变异分析

（1）SRAP（相关序列扩增多态性）检测。取蝴蝶兰瓶苗嫩叶及继代培养第0、8、16、24个月的PLB进行SRAP检测。DNA提取采用CTAB法，纯度、浓度检测以A260和A280检测吸光度法和琼脂糖凝胶电泳法。按照Li和Quiros[15]的SRAP引物设计原则设计引物。SRAP-PCR体系（25 μL）包括模板DNA 40 ng、Mg2+ 2.0 mmol/L、引物0.8 μmol/L、Taq酶1 U。扩增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，35 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，5个循环；94 ℃ 1 min，50 ℃1 min，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。琼脂糖凝胶电泳及成像。

（2）DNA胞嘧啶甲基化水平。以培养第0、8、16、24个月的PLB为材料。DNA提取、水解、高效液相色谱参照刘福平等[16]介绍的方法。样品在25 ℃下注入HPLC（Waters2695）的Hypersil BDS C18柱（200 mm×4.0 mm，5μm）（大连伊利特分析仪器有限公司提供）分离， 柱温25 ℃。流动相由甲醇、戊烷磺酸钠（10 mmol/L）、三乙胺按体积比3 ∶ 90 ∶ 0.2配成，pH4.0，流速1.0 mL/min。胞嘧啶（C）及5-甲基胞嘧啶（5 mC）购自SIGMA公司，检测波长273 nm，分别取胞嘧啶和甲基胞嘧啶系列标准溶液进行测定，以峰面积（S）对标准进样量（摩尔数，M）作回归方程，胞嘧啶回归方程为MC=3.054×10-10×SC-1.598×10-5，R2=0.999 6，甲基胞嘧啶回归方程M5 mC=5.684×10-10×S5 mC+2.973×10-5，R2=0.999 7。根据PLB样品DNA水解产物中C和5 mC的洗脱峰面积，计算样品中C和5 mC的摩尔数，DNA甲基化水平=5 mC/（C+5 mC）×100%。

1.3 数据分析

对照组、处理组分别在不同培养时间观测数据的组间差异显著性比较按Dunnett最小显著差数（DLSD）测验法。同一培养时间的对照组与处理组间差异显著性比较采用t检验法。

2 结果与分析

2.1 抗氧化剂对长期继代类原球茎氧化指标的效应

培养基添加抗氧化剂继代培养蝴蝶兰PLB 24个月，总活性氧、羟自由基（·OH）相对含量、超氧阴离子（O2·- ）生成速率、过氧化氢（H2O2）含量和丙二醛（MDA）含量变化见表1。

2.1.1 总活性氧（T-ROS）水平变化 培养起始（0个月）PLB的总活性氧水平67.62 U/mL，培养第8个月，对照组显著提高，处理组极显著降低，随后两组都随继代培养时间延长升高，都达极显著水平。培养期间3个时间点，处理组总活性氧水平均较对照组极显著降低。

2.1.2 羟自由基（·OH）相对含量变化 培养起始（0个月）PLB的·OH相对含量0.503 ΔA420/（min·g FW），培养第8个月，对照组变化不明显，处理组显著降低，随后两组都随培养时间延长而升高，第16个月，都显著升高，第24个月都极显著升高。处理组和对照组比较，培养第8个月，处理组较对照显著降低，第16个月差异不显著，第24个月较对照组极显著降低。

2.1.3 超氧阴离子（O2·- ）生成速率变化 培养起始（0个月）PLB的O2·- 生成速率1.593 μmol/（min·g FW），培养第8个月，对照组显著提高、处理组没显著变化，随后都随培养时间延长升高，第16、24个月，两组都较初代极显著升高。培养第8个月处理组较对照显著降低，第16个月极显著降低，第24个月差异不显著。

2.1.4 过氧化氢（H2O2）含量变化 培养起始（0个月）PLB的H2O2含量为134.7 μmol/g FW，培養第8个月，对照组H2O2含量没显著差异，处理组显著降低，第16个月两组都极显著升高，第24个月对照组仍极显著升高，处理组有所回落，但仍较初代显著升高。培养第8个月，处理组较对照极显著降低，第16个月显著升高，第24个月显著降低。

2.1.5 丙二醛含量变化 培养起始（0个月）PLB的丙二醛含量为1.203 μmol/g FW，培养第8个月，对照组、处理组均没明显变化，第16个月对照组极显著升高，处理组显著升高，第24个月都极显著升高。处理组和对照组比较，培养第8、16个月，处理组均较对照显著降低，第24个月则极显著降低。

从上所述可以看出，在整个培养期间，对照组总活性氧水平消长趋势与O2·- 生成速率都随培养时间延续而升高，趋势相对较为一致，处理组总活性氧水平先抑后扬，与·OH相对含量消长趋势较为一致。对照组丙二醛含量随培养时间延续而升高，与总活性氧水平变化趋势较一致，处理组丙二醛含量与总活性氧水平都是先抑后扬（但丙二醛含量在第8个月的降低没有达到显著水平），大体上较为协同。

2.2 抗氧化剂对长期继代类原球茎的DNA变异的效应

2.2.1 DNA的SRAP分析 SRAP-PCR 扩增结果见图1。1号为用于诱导PLB的瓶苗叶片，2号为培养初始的PLB，3～5号为对照组分别在8、16、24个月PLB，6～8号为处理组分别在8、16、24个月PLB。所有样品扩增条带大小在50～1 000 bp之间，扩增条数在2～6条之间，各样品间呈现一定的多态性。1号叶子PCR结果明显与2～8号PLB不同，其中有4条带都与其他样品不同，多态性差异明显，说明从叶子诱导出PLB就有DNA水平变异。2～8号条带相近，说明继代培养期间PLB并未发生明显的DNA差异，培养基添加抗氧化剂与对照PLB也并未发生明显的DNA差异。

2.2.2 DNA甲基化水平分析 培养基添加抗氧化剂长期继代培养PLB期间DNA胞嘧啶甲基化程度变化见表2。从表2可以看出， 培养起始PLB的DNA甲基化程度为17.7%，对照组和处理组在第8个月都没显著变化，随着继代培养时间延长，DNA甲基化程度逐渐提高，都达极显著水平。处理组、对照组甲基化程度在第8个月差异不显著，在第16个月处理组极显著降低，第24个月显著降低。

3 讨论与结论

自由基在生理衰老和遗传变异上均有重要的效应[9-10]，本实验继代培养蝴蝶兰PLB，添加抗氧化剂处理组、对照组总活性氧水平都有所提高，处理组与同时点的对照相比都较低，即半胱氨酸与甘露醇复合抗氧化剂能降低PLB总活性氧水平。整个培养期间总活性氧水平变化趋势与主要活性氧指标之间的关系，对照组总活性氧与O2·- 消长趋势相对较为一致，推测O2·- 是总活性氧水平变化的主要影响因素，处理组·OH消长趋势与总活性氧相对较为一致，·OH可能是主要影响因素，主要影响因素不同，可能因处理组在培养基添加抗氧化剂所致。膜脂过氧化产物丙二醛干扰细胞代谢活动，破坏生物膜结构，李仲芳等[17]在连续继代培养鹅掌楸丛生芽中，O2·- 和丙二醛含量呈现逐渐增加的趋势。本实验PLB继代培养期间，对照组、处理组丙二醛含量变化趋势都与总活性氧变化相似，处理组丙二醛含量较同时期的对照组低，说明抗氧化剂对降低PLB丙二醛含量有一定的效果。

PLB的SRAP-PCR扩增结果，叶子PCR结果与所有PLB多态性明显， 说明从叶子诱导出PLB就有DNA水平变异。所有PLB扩增条带相近，说明继代培养期间PLB并未发生明显的DNA差异，培养基抗氧化剂也并未导致明显的DNA差异。长期继代的组培无性系在分子水平无明显变异已有一些报道，叶艺春兰克隆繁殖的第9代到第20代组培苗DNA分析未见明显差异[5]，铁皮石斛的7代无性繁殖苗，第4代之后代间仅有部分引物RAPD带型发生甚微变化[6]，从继代18次霍山石斛PLB分化的幼苗RAPD分析，不同代PLB的幼苗之间、长期继代与供体母株之间均没有显著遗传变异[8]，其他如长期继代再生能力丧失的纽荷尔脐橙愈伤组织[18]，长期继代蛇麻草愈伤组织再生苗[19]，继代5次的滇黄芩组培苗[20]都没检出明显带型差异。

在植物离体培养过程中，遗传和表观遗传变异都可能是引起长时间培养材料丧失分化能力的一个重要原因[1，21]，有报道DNA甲基化水平随着继代代数和时间的增加而增加[18，22，23]，本实验的PLB在培养的第16、24个月，处理组、对照组的DNA甲基化水平都较初代提高，但对照组或处理组的SRAP检测未发现明显变异，上述的纽荷尔脐橙、蛇麻草事例中，采用分子标记均未检测出多态性条带，纽荷尔脐橙愈伤组织胚状体再生能力丧失，作者认为可能是相关基因发生甲基化修饰造成的[18]，蛇麻草也检测出了甲基化变化，认为这种变化是逐渐形成[19]。

氧化胁迫（活性氧）诱发DNA甲基化程度提高或降低各有报道[24]，本实验不管是对照组还是处理组，在继代培养中后期，PLB的DNA甲基化程度提高，与总活性氧水平逐渐提高大体对应，至于添加抗氧化剂（含半胱氨酸和甘露醇）处理组DNA甲基化程度较对照组低，杜亚琼等[25]报道50 mmol/L甘露醇对拟南芥种子萌发率、幼苗生长几乎没影响，基因组DNA甲基化水平均低于对照，有报道葫芦巴碱、甜菜碱和胆碱[26]、茶多酚类[27]具有去甲基化效应，而它们都具较强抗氧化性，所以，本实验中抗氧化剂可能与PLB的DNA甲基化程度降低有关。

活性氧自由基在植物生理衰老和遗传变异上均有重要的效应。本实验的生理指标方面，抗氧化剂使继代培养类原球茎总活性氧水平降低，从而丙二醛含量也降低，减轻了丙二醛对细胞生理毒害，有利于减轻继代蝴蝶兰类原球茎增殖、分化能力下降。类原球茎DNA稳定性分析未发现明显多态性，即核苷酸序列并没有检出变异，处理组DNA甲基化程度较对照组低，可能也是抗氧化剂减轻长期继代蝴蝶兰类原球茎增殖、分化能力下降的原因之一。本研究结果为克服长期继代蝴蝶兰类原球茎应用上存在障碍的研究提供借鉴，也为利用化学调控解决或缓解植物培养物长期继代的衰老研究提供基础。

参考文献

[1] 刘玲梅， 汤浩茹， 刘 娟. 试管苗长期继代培养中的形态发生能力与遗传稳定性[J]. 生物技术通报， 2008（5）： 22-27.

[2] 顾德峰， 赵春莉， 宋彦君， 等. 蝴蝶兰无性快繁规模化生产的研究[J]. 园艺学报， 2007， 34（1）： 193-196.

[3] 高汝勇， 李会芬， 骆冬洁. 蝴蝶兰的快速繁殖研究[J]. 衡水学院学报， 2007， 9（1）： 27-29.

[4] 侯大强， 柴明良， 莊晓英. 长期离体培养的春石斛兰类原球茎生长及生根条件的优化[J]. 核农学报， 2006， 20（5）： 392-394.

[5] 高 丽， 杨 波， 李洪林. 叶艺春兰组培苗遗传稳定性的ISSR研究[J]. 亚热带植物科学， 2007， 36（2）： 13.

[6] 刘石泉， 李小军， 周根余. 铁皮石斛不同繁殖代数遗传稳定性RAPD的研究[J]. 江南大学学报（自然科学版）， 2005， 4（5）： 518-521.

[7] 邱 婧， 樊洪泓， 秦自清， 等. 利用分子标记检测霍山石斛不同继代次数试管苗的遗传稳定性[J]. 分子植物育种， 2008， 6（3）： 532-536.

[8] Zha X Q， Luo J P. Production stability of active polysaccharides of Dendrobium hulshanense using long-term cultures of protocorm-like bodies[J]. Planta Medica， 2008（1）： 90-93.

[9] 阎成士， 李德全， 张建华. 植物叶片衰老与氧化胁迫[J]. 植物学通报， 1999， 16（4）： 398-404.

[10] Brat E A， Bailey-Serres J， Wetertilnyk E. Responses to abiotic stresses[M]//Buchanan B B， Gruissem W， Jones R L（eds）. Biochemistry and molecular biology of plants. American Society of Plant Physiologists， Rockville， 2000： 1 158-1 203.

[11] 刘福平， 陈丽璇. 蝴蝶兰胚性愈伤组织诱导的氧化还原动态[J]. 武汉植物学研究， 2010， 28（6）： 738-744.

[12] 汤章成. 现代植物生理学实验指南[M]. 北京： 科学出版社， 1999： 305-306， 308-309.

[13] 宋松泉， 程红炎， 龙春林， 等. 种子生物学研究指南[M]. 北京： 科学出版社， 2005： 108-109.

[14] 沈文飚， 叶茂炳， 徐朗莱， 等. 小麦旗叶自然衰老过程中清除活性氧能力的变化[J]. 植物学报， 1997， 39（7）： 634-640.

[15] Li G， Quiros C F. Sequence-related amplified polymorphism（SRAP）， a new marker system based on a simple PCR reaction： its application to mapping and gene tagging in Brassica[J]. Theor Appl Genet， 2001， 103： 455-461.

[16] 刘福平， 陈 淳， 张文惠. 蝴蝶兰类原球茎总DNA甲基化水平测定方法[J]. 核农学报， 2010， 24（4）： 751-756 .

[17] 李仲芳， 路承香， 高彦明， 等. 峨眉山珍稀植物鹅掌楸组培过程中的膜脂过氧化[J]. 基因组学与应用生物学， 2009， 28（5）： 951-954.

[18] 郝玉金. 柑桔和苹果等果树种质资源的离体保存及其遗传变异[D]. 武汉： 华中农业大学， 2000.

[19] Peredo E L， Revila M A， Arroyo-Gareia R. Assessment of genetic and epigenetic variation in hop plants regenerated from sequential subcultures of organogenic calli[J]. Journal of Plant Physiology， 2006， 163（10）： 1 071-1 079.

[20] 岑举人， 步怀宇， 王英娟， 等.滇黄芩器官发生与不同继代次数遗传稳定性的RAPD分析[J]. 基因组学与应用生物学， 2009， 28（2）： 289-292.

[21] Valledor L， Hasbun R， Meijon M， et al. Involvement of DNA methylation in tree development and micropropagation[J]. Plant Cell Tiss Organ Cult， 2007， 9（1）： 75-86.

[22] Fraga M F， Rodriguez R， Canal M J. Genomic DNA methylation demethylation during aging and reinvigoration of Pinus radiate[J]. Tree Physiol， 2002， 22： 813-816.

[23] Peredo E L， Arroyo-García R， Revilla M. Epigenetic changes detected in micropropagated hop plants[J]. Plant Physiol， 2009， 166： 1 101-1 111.

[24] 赵云雷， 叶武威， 王俊娟， 等. DNA甲基化与植物抗逆性研究进展[J]. 西北植物学报， 2009， 29（7）： 1 479-1 489.

[25] 杜亚琼， 王子成. 甘露醇对拟南芥基因组DNA甲基化的影响[J]. 植物学报， 2011， 46（3）： 285-292.

[26] Berglund T. Nicotinamide， a missing link in the early stress response in eukaryotic cells： a hypothesis with special reference to oxidative stress in plants[J]. FEBS Lett， 1994， 351： 145-149.

[27] 李培坤， 耿小平， 朱立新. DNA甲基化抑制剂研究进展[J]. 国际药学研究杂志， 2010， 37（3）： 198-202.

责任编辑：沈德发