甘蔗与斑茅割手密复合体的回交后代真实性鉴定及染色体遗传分析

黄玉新 罗霆 高轶静 张保青 周珊 杨翠芳 段维兴 雷敬超 韦金菊 张革民 李杨瑞

摘要：【目的】掌握斑茅割手密复合体（简称斑割复合体）在杂交利用过程中的染色体遗传规律，为斑割复合体适宜回交利用代数提供参考依据。【方法】选用4对引物对甘蔗与斑茅割手密复合体的回交后代进行SSR标记鉴定，并利用甘蔗根尖细胞酶解去壁低渗法对真实杂种进行染色体数目观察。【结果】供试的28个杂交后代材料（15个GT05-164与GXASF108-2-28杂交BC1代，13个GT42与GXASBC112-A6-25杂交BC2代）均为真实杂种。选择在2对SSR引物中均扩增出父本特征带的后代（5个BC1代和7个BC2代）进行染色体观察，结果发现，5个BC1代的染色体数目介于95～98条，其染色体按“n+n”方式传递；7个BC2代的染色体数目介于94～101条，其染色体也按“n+n”方式传递。【结论】甘蔗与斑割复合体杂交BC1和BC2代中染色体传递方式均为“n+n”，母本甘蔗的染色体未加倍，高贵化育种进程减慢，可能需要更高的杂交代数才能获得聚集斑茅和割手密血缘的优良品种（系）。

关键词： 甘蔗；斑割复合体；杂交后代；SSR标记；染色体传递

中图分类号： S566.1 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）10-1642-06

0 引言

【研究意义】甘蔗（Saccharum officinarum）是禾本科高光效C4作物，也是全球性最高效的糖能兼用可再生能源作物（廖芩等，2015）。但由于长期的种间种内近交，育成品种的生活力、适应性、抗逆性、宿根性等普遍下降，致使甘蔗育种工作难以取得重大进展。甘蔗野生种质斑茅和割手密具有抗逆性强、适应性广、多蘖、宿根性强等优良特性（Piperidis et al.，2000）。斑茅割手密复合体（简称斑割复合体）为斑茅与割手密的属间杂种，遗传了双亲的优点，且在长势、综合农艺性状及抗性上具有超亲优势（高轶静等，2012；刘昔辉等，2012a）。因此，开展甘蔗远缘杂交工作，引进斑茅和割手密的優异基因，既能丰富甘蔗品种的遗传背景，又可有效提高育成品种的综合水平。【前人研究进展】至今，国内外已有关于甘蔗与其近缘野生种进行杂交利用的研究报道。林秀琴等（2013）利用基因组原位杂交技术（GISH）对滇蔗茅与热带种杂交F1代染色体组成进行研究，结果发现杂种F1代染色体以“n+n”方式进行传递，但由于滇蔗茅与热带种杂交F1代花粉高度不育，难以用作父本改良现有甘蔗品种，导致滇蔗茅种质资源优异基因的挖掘利用受到极大阻碍。王先宏等（2014）采用常规压片法对甘蔗与蔗茅杂交F2BC1代的染色体数目进行传递分析，结果表明，在观察的5个后代中体细胞染色体数目均不恒定，存在3～7条的变幅；F2代材料04/14的染色体遗传方式为“2n+n”，而F2BC1代的染色体遗传方式为“n+n”。Wu等（2014）、Huang等（2015）先后利用GISH探讨斑茅染色体在杂交后代的遗传模式，结果发现部分BC1材料中染色体以特殊的“2n+n”方式传递，而BC2、BC3代中的染色体以“n+n”方式传递。【本研究切入点】根据前人的相关研究结果可知，尽管已获得不少高世代的含斑茅或滇蔗茅血缘的材料，但至今未见有品种育成。【拟解决的关键问题】本课题组前期通过利用广西斑割复合体GXAS07-6-1（2n=62）与甘蔗杂交，获得一批经分子标记鉴定为真实杂种且表现优良的育种新材料（高轶静等，2012；刘昔辉等，2012a；刘许辉，2013），其杂交后代的染色体基本按“n+n”方式传递，但不排除存在部分染色体加倍现象（黄玉新等，2016）。因此，有必要采用SSR标记对杂交BC1、BC2代进行真实性鉴定，并对部分真实杂种进行染色体观察、计数，掌握斑割复合体在杂交利用过程中的染色体遗传规律，为斑割复合体适宜回交利用代数提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试材料包括斑割复合体杂交利用过程中的2个世代（BC1、BC2）及其双亲（表1）。BC1代的母本为GT05-164（广西农业科学院甘蔗研究所选育品系，不含斑茅血缘），父本为甘蔗与斑割复合体杂交F1代GXASF108-2-28（广西农业科学院甘蔗研究所选育品系，含广西斑茅GXA87-36和广西割手密GXS79-9血缘），其染色体为98条（黄玉新等，2016）。BC2代的母本为GT42（广西农业科学院甘蔗研究所选育品种，不含斑茅血缘），父本为BC1真实杂种GXASBC112-A6-25。

1. 2 SSR-PCR扩增

基因组DNA提取参考高轶静等（2012）的SDS法，应用SSR标记对杂交后代的真实性进行鉴定。SSR引物（表2）设计参考Cordeiro等（2000）、Oliveira等（2009）的研究方法，并委托上海捷瑞生物工程公司合成。PCR反应体系20.0 μL，包括10×Buffer（含2 mmol/L MgCl2）2.0 μL，dNTP（10 mmol/L）0.4 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，DNA样品40 ng，Taq DNA聚合酶1 U，ddH2O补足至20.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，进行35个循环；72 ℃延伸5 min。扩增产物在7%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，硝酸银染色观察。

1. 3 杂交后代真实性鉴定

以亲本DNA为模板，筛选出父母本间具有父本特征性条带的引物对杂交后代进行真实性鉴定，当杂交后代扩增产物具有父本特征条带，则判定为真杂种；如仅含有母本条带而无父本特征带的后代，是无法确定其真实性，还需采用其他引物进行鉴定。

1. 4 染色体观察及计数

染色体玻片制备参考吴嘉云（2013）的方法。蔗茎在28 ℃恒温保湿沙培条件下发根，长至1～2 cm时，于上午9：00～10：00（夏季）或11：00～11：30（冬季）选取幼嫩的根尖置于饱和对二氯苯水溶液中室温处理3～5 h，以现配卡诺氏固定液4 ℃固定12 h以上，再经0.075 mol/L KCl低渗处理1 h，于4 ℃下用70%酒精保存备用。制片时，取出根尖用0.25 mol/L HCl酸解10 min，再转移至混合酶液（纤维素酶∶果胶酶=3.50%∶1.75%）中37 ℃恒温酶解约8 h。酶解后的根尖用火焰干燥法制片，以改良苯酚卡宝品红染色后显微镜下观察并拍照，选择20个以上背景清晰、分散完整的染色体进行计数。

2 结果与分析

2. 1 GT05-164与GXASF108-2-28杂交BC1代的SSR鉴定结果

筛选出2对SSR引物对15个GT05-164与GXASF108-2-28杂交BC1代进行真实性鉴定，结果如图1所示。引物ESTC64（左）共扩增出3条父本特征带（箭头所示），约位于180、430和560 bp处，12-A6-1、12-A6-3、12-A6-5、12-A6-16、12-A6-21、12-A6-28、12-A6-29等7个BC1代均能扩增获得这3条父本特征带及约位于210 bp处的父母本共有带。引物ESTC78（右）共扩增出2条父本特征带（箭头所示），约位于145和210 bp处，12-A6-3、12-A6-4、12-A6-5、12-A6-9、12-A6-10、12-A6-14、12-A6-19、12-A6-20、12-A6-25、12-A6-27、12-A6-28、12-A6-29等12个BC1代均能扩增获得1～2条父本特征带及约位于170 bp处的父母本共有带。综合2对引物的扩增结果可知，15个BC1代均为真实杂种，其中12-A6-3、12-A6-5、12-A6-28、12-A6-29在2对SSR引物中均能扩增出父本特征带。

2. 2 GT42与GXASBC112-A6-25杂交BC2代的SSR鉴定结果

筛选出2对SSR引物对13个GT42与GXASBC112- A6-25杂交BC2代进行真实性鉴定，结果如图2所示。引物mSSCIR41（左）能扩增出5条父本特征条带（箭头所示），约位于170、180、220、500和550 bp处，15-461-3、15-461-5、15-461-7、15-461-9、15-461-11、15-461-12、15- 461-13、15-461-17等8个BC2代均能扩增出1条或1条以上的父本特征带及约120 bp处的父母本共有带。引物EST2-14（右）扩增出2条父本特征条带（箭头所示），约位于120和340 bp处。除15-461-9以外，其余12个BC2代均能扩增出1～2条父本特征条带及约位于90、220和230 bp处的3条父母本共有带。综合2对引物的扩增结果可知，13个BC2代均为真实杂种，其中15-461-3、15-461-5、15-461-7、15-461-11、15-461-12、15-461-13、15-

461-17在2对SSR引物中均能扩增出父本特征带。

2. 3 甘蔗×斑割复合体杂交BC1、BC2代染色体数目和传递方式推断

选择在2对SSR引物中均扩增出父本特征带的后代（除12-A6-25外）进行染色体观察，包括5个BC1代和7个BC2代，结果如图3和表3所示。由表3可知，在5个BC1代组合中，亲本及其子代的体细胞染色体数目均不恒定，变幅为6～9条。由于BC1代母本GT05-164的染色体为104条（众数，下同），父本GXASF108-2-28的染色体为98条，双亲的配子体染色体数目之和为101条，5个BC1代的染色体数目介于95～98条，故推测甘蔗与斑割复合体杂交BC1代染色体基本按“n+n”方式传递。在7个BC2代组合中，亲本及其子代的体细胞染色体数目也均不恒定，变幅为4～10条。母本GT42的染色体为107条，父本GXASBC112-A6-25的染色体为96条，双亲的配子体染色体数目之和为102条，7个BC2代的染色体数目介于94～101条，由此推测甘蔗与斑割复合体杂交BC2代染色体也基本按“n+n”方式传递。

3 讨论

杂交后代真实性鉴定是利用甘蔗野生种质拓宽遗传基础进行种质创新研究的根本。目前用于杂种真实性鉴定的方法主要有形態学、细胞学、同工酶及分子标记等方法（黄家雍等，1997；刘文荣等，2004；郑雪芳等，2004）。SSR标记为共显性标记，其操作简单、重复性好、结果可靠，是杂种真实性鉴定的有效手段（阴云伙等，2015；张恩慧等，2016）。桃联安等（2009）对20个云南割手密82-114种间杂交后代进行鉴定，利用2对SSR引物鉴定出15个真实杂种；刘昔辉等（2012b）研究表明，SSR标记可用于甘蔗与河八王属间杂种的真实性鉴定；陆鑫等（2012）对热带种与滇蔗茅远缘杂交F1代进行SSR鉴定，结果发现鉴定的62个F1代均为真实杂种，所选用的4对引物表现出较高的鉴定效率。本研究利用SSR标记对甘蔗与斑割复合体杂交BC1、BC2代进行真实性鉴定，每个组合筛选出父本特征带清晰且多态性丰富的2对引物进行鉴定，结果表明，供试的28个杂交后代均为真实杂种，其中部分材料在2对引物中均能扩增出父本特征带，鉴定效率较高。

由于甘蔗为异源多倍体物种，遗传背景较复杂（杨翠凤等，2015），染色体传递方式有多种形式，且减数分裂过程染色体不能正常配对，会产生不平衡配子，造成同一亲本组合后代染色体数目并不完全不一致。本研究对5个BC1代和7个BC2代进行染色体观察，结果表明，甘蔗与斑割复合体杂交BC1、BC2代染色体数目分别为95～98和94～101条，而双亲各自单倍的配子体染色体数目之和分别为101和102条，染色体基本按“n+n”方式传递，但同时存在部分染色体丢失现象。

在甘蔗的高贵化育种过程中，染色体传递方式为“2n+n”，杂种后代获得母本热带种的全套染色体，其高糖的特性得以稳定遗传，同时获得父本野生种的一半染色体，经过多次回交，野生种血缘不断减少，不良特性也随之减少，因此，能够快速选育出高产、高糖、抗性好的材料。Wu等（2014）对斑茅染色体遗传的研究发现，在观察的13个BC1代中有4个后代遗传方式为“2n+n”，但这4个BC1代来自两个不同亲本组合，由此表明“2n+n”的传递方式并不限于个别植株。本研究仅观察了5个BC1代和7个BC2代，且均来自一个亲本组合，如观察更多的组合或斑割复合体与不同甘蔗进行正反交是否也会存在“2n+n”遗传方式，尚有待进一步探究。

4 结论

甘蔗与斑割复合体杂交BC1和BC2代中染色体传递方式均为“n+n”，母本甘蔗的染色体未加倍，高贵化育种进程减慢，可能需要更高的杂交代数才能获得聚集斑茅和割手密血缘的优良品种（系）。

参考文献：

高轶静，方锋学，刘昔辉，张荣华，宋焕忠，杨荣仲，罗霆，段维兴，游建华，张革民. 2012. 甘蔗与斑茅割手密复合体杂交后代的分子标记鉴定[J]. 植物遗传资源学报，13（5）：912-916.

Gao Y J，Fang F X，Liu X H，Zhang R H，Song H Z，Yang R Z，Luo T，Duan W X，You J H，Zhang G M. 2012. Identification of progeny from crosses between sugarcane（Saccharum spp.） and intergeneric hybrid complex（Erianthus arundinaceus×Saccharum spontaneum） with molecular markers[J]. Journal of Plant Genetic Resources， 13（5）：912-916.

黄家雍，廖江雄，诸葛莹. 1997. 甘蔗与河八王、五节芒、滇蔗茅属间交配性及杂种F1无性系的形态学和同工酶分析[J]. 西南农业学报，10（3）：92-98.

Huang J Y，Liao J X，Zhu G Y. 1997. Intergeneric copulatality of Saccharum L. with Narenga porphyrocoma， Miscamthus floridulus and Erianthus kockii， the morphologr and isozyme analysis of their hybris F1 clones[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，10（3）：92-98.

黄玉新，罗霆，刘昔辉，周珊，杨翠芳，高轶静，杨翠凤，段维兴，周会，张革民，李杨瑞. 2016. 甘蔗与斑茅割手密复合体（GXAS07-6-1）杂交后代的染色体遗传分析[J]. 热带作物学报，37（2）：220-225.

Huang Y X，Luo T，Liu X H，Zhou S，Yang C F，Gao Y J，Yang C F，Duan W X，Zhou H，Zhang G M，Li Y R. 2016. Gene-

tic analysis of chromosomes for the progeny between sugarcane（Saccharum spp.） and intergeneric hybrid complex （Erianthus arundinaceus×Saccharum spontaneum）[J]. Chinese Journal of Tropical Crops，37（2）：220-225.

廖芩，黄河星，黄兴，杨善，莫俊杰，周鸿凯. 2015. 甘蔗物理诱变M2代株系的ISSR分析[J]. 江西农业学报，27（7）：28-30.

Liao Q，Huang H X，Huang X，Yang S，Mo J J，Zhou H K. 2015. ISSR analysis of physically-mutated sugarcane strains in M2 generation[J]. Acta Agriculturae Jiangxi，27（7）：28-30.

林秀琴，陆鑫，毛钧，刘新龙，苏火生，蔡青. 2013. 甘蔗属热带种与滇蔗茅远缘杂交F1代GISH分析[J]. 西南农业学报，26（4）：1327-1331.

Lin X Q，Lu X，Mao J，Liu X L，Su H S，Cai Q. 2013. GISH analysis of intergeneric F1 hybrids between Saccharum officinarum and Erianthus rockii[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，26（4）：1327-1331.

刘文荣，邓祖湖，张木清，卓晓蕾，符成，张垂明. 2004. 甘蔗斑茅的杂交利用及其杂种后代鉴定系列研究Ⅲ. 甘蔗斑茅远缘杂交后代细胞遗传分析[J]. 作物学报，30（11）：1093-1096.

Liu W R，Deng Z H，Zhang M Q，Zhuo X L，Fu C，Zhang C M. 2004. Use and characterization of the genuine intergeneric hybrids from the cross of Saccharum spp. and E. arundinaceum Retz. Ⅲ. Cytogenetic analysis for the hybrid and backcross progeny of S. officinarum L. and Erianthus sect. Ripidium[J]. Acta Agronomica Sinica，30（11）：1093-1096.

劉昔辉，方锋学，高轶静，张荣华，宋焕忠，杨荣仲，方位宽，段维兴，罗霆，张革民，李杨瑞. 2012a. 斑茅割手密杂种后代真实性鉴定及遗传分析[J]. 作物学报，38（5）：914-920.

Liu X H，Fang F X，Gao Y J，Zhang R H，Song H Z，Yang R Z，Fang W K，Duan W X，Luo T，Zhang G M，Li Y R. 2012a. Identification and genetic analysis of hybrid from cross between Erianthus arundinacius（Retz.） Jesws. and Saccharum spontaneum L.[J]. Acta Agronomica Sinica，38（5）：914-920.

刘昔辉，方锋学，张荣华，宋焕忠，杨荣仲，高轶静，区惠平，雷敬超，罗霆，段维兴，张革民，李杨瑞. 2012b. 甘蔗与河八王属间杂种的SSR 标记鉴定[J]. 西南农业学报，25（1）：38-43.

Liu X H，Fang F X，Zhang R H，Song H Z，Yang R Z，Gao Y J，Ou H P，Lei J C，Luo T，Duan W X，Zhang G M，Li Y R. 2012b. Identification of progenies from Sugarcane×Narenga porphyrocoma（Hance） Bor. by SSR marker[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，25（1）：38-43.

刘许辉. 2013. 甘蔗与斑茅割手密复合体杂交后代的遗传分析[D]. 南宁：广西大学.

Liu X H. 2013. Genetic analysis for the progenies from the cross Saccharum with the hybrid of Erianthus arundinaceus （Retz.） Jeswiet and Saccharum spontaneum L.[D]. Nanning：Guangxi University.

陆鑫，毛钧，刘洪博，刘新龙，马丽，苏火生，蔡青. 2012. 甘蔗野生种滇蔗茅种质创新利用研究Ⅰ. 甘蔗与滇蔗茅远缘杂交 F1群体构建与SSR分子标记鉴定[J]. 植物遗传资源学报，13（2）：321-324.

Lu X，Mao J，Liu H B，Liu X L，Ma L，Su H S，Cai Q. 2012. Innovation germplasm of Erianthus rockii I. Establishment of F1 intergeneric distant hybridization of Saccharum officinarum L. and Erianthus rockii and the identification of F1 by SSR molecular markers[J]. Journal of Plant Genetic Resources，13（2）：321-324.

桃联安，楚连璧，经艳芬，刘新龙，安汝东，董立华，杨李和，周清明，段惠芬. 2009. 云南割手密82-114种间杂交后代SSR分子标记鉴定[J]. 植物遗传资源学报，10（1）：132-135.

Tao L A，Chu L B，Jing Y F，Liu X L，An R D，Dong L H，Yang L H，Zhou Q M，Duan H F. 2009. Identification of genuine hybrids from the cross of chewing cane and Saccharum spontaneum in Yunnan by SSR markers[J]. Journal of Plant Genetic Resources，10（1）：132-135.

王先宏，李富生，何丽莲，娄红波，杨清辉，何顺长. 2014. 甘蔗与蔗茅杂交F2BC1代的染色体遗传分析[J]. 中国农学通报，30（15）：81-85.

Wang X H，Li F S，He L L，Lou H B，Yang Q H，He S C. 2014. Chromosomal transmission of F2BC1 progenies between su-

garcane and Erianthus fulvus[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin，30（15）：81-85.

吴嘉云. 2013. 甘蔗与斑茅后代染色体遗传分析及抗性初步评价[D]. 福州：福建农林大学.

Wu J Y. 2013. The chromosome inheritance for the hybrid progeny of S. officinarum L. and E. arundinaceum and germplasm resistance preliminary evaluation[D]. Fuzhou：Fujian Agricultural and Forestry University.

杨翠凤，张春雅，杨丽涛，李杨瑞. 2015. 不同基因型甘蔗種质资源的表型遗传多样性[J]. 广西植物，35（4）：556-563.

Yang C F，Zhang C Y，Yang L T，Li Y R. 2015. Phenotypic and genetic diversity of sugarcane（Saccharum L.） protospecies and landraces[J]. Guihaia，35（4）：556-563.

阴云伙，温和楦，陈龙，程攀，曲姗姗，田发春，彭炳生，吴帅，李土明，周卫营. 2015. 利用SSR标记鉴定两系杂交稻“广两优 7203”的种子纯度[J]. 江西农业学报，27（11）：20-22.

Yin Y H，Wen H X，Chen L，Cheng P，Qu S S，Tian F C，Peng B S，Wu S，Li T M，Zhou W Y. 2015. Identification of seed purity of two-line hybrid rice“Guangliangyou 7203” by using SSR markers[J]. Acta Agriculturae Jiangxi，27（11）：20-22.

张恩慧，王晓云，覃子海，赵文东，韦长江，王鹏良. 2016. 广西普通油茶种质资源遗传多样性的SSR分析[J]. 广西植物，36（7）：806-811.

Zhang E H，Wang X Y，Qin Z H，Zhao W D，Wei C J，Wang P L. 2016. Genetic diversity analysis of Camellia oleifera in Guangxi using SSR markers[J]. Guihaia，36（7）：806-811.

郑雪芳，张木清，李奇伟，劳方业，邓祖湖，陈如凯，杨业后. 2004. 甘蔗斑茅的杂交利用及其杂种后代鉴定系列研究（二）：甘蔗斑茅远缘真实杂种的分子鉴定[J]. 分子植物育种，2（1）：35-42.

Zheng X F，Zhang M Q，Li Q W，Lao F Y，Deng Z H，Chen R K，Yang Y H. 2004. Utilization and characterisation of the genuine intergeneric hybrids from the cross of Saccharum and E. arundinaceum（2）：molecular identification of genuine hybrids from the cross of Saccharum and E. arundinaceum[J]. Molecular Plant Breeding，2（1）：35-42.

Cordeiro G M，Taylor G O，Henry R J. 2000. Characterisation of microsatellite markers from sugarcane（Saccharum spp.）， a highly polyploid species[J]. Plant Science，155（2）：161-168.

Huang Y J，Wu J Y，Wang P，Lin Y Q，Fu C，Deng Z H，Wang Q N，Li Q W，Chen R K，Zhang M Q. 2015. Characterization of chromosome inheritance of the intergeneric BC2 and BC3 progeny between Saccharum spp. and Erianthus arundinaceus[J]. PLoS One，10（7）：e0133722.

Oliveira K M，Pinto L R，Marconi T G，Mollinari M，Ulian E C，Chabregas S M，Falco M C，Burnquist W，Garcia A A，Souzaa A P. 2009. Characterization of new polymorphic functional markers for sugarcane[J]. Genome，52（2）：191-209.

Piperidis G，Christopher M J，Carroll B J，Berding N，DHont A. 2000. Molecular contribution to selection of intergeneric hybrids between sugarcane and the wild species Erianthus arundinaceus[J]. Genome，43（6）：1033-1037.

Wu J Y，Huang Y J，Lin Y Q，Fu C，Liu S M，Deng Z H，Li Q W，Huang Z X，Chen R K，Zhang M Q. 2014. Unexpected inheritance pattern of Erianthus arundinaceus chromosomes in the intergeneric progeny between Saccharum spp. and Erianthus arundinaceus[J]. PLoS One，9（10）：e110390.

（責任编辑 兰宗宝）