春石斛品种Dendrobium Second Love‘Tokimeki’与金钗石斛多糖免疫活性的比较研究

王再花　李杰　章金辉　徐晔春　叶庆生

摘 要 为比较春石斛栽培品种Dendrobium Second Love‘Tokimeki与金钗石斛的粗多糖、精多糖（除蛋白多糖）和多糖水洗组分（过层析柱分离的水洗组分）的免疫活性差异，分别对昆明小鼠灌胃上述6种不同纯度的多糖，观察其对小鼠脏体指数、迟发性变态反应、抗体积数和小鼠腹腔巨噬细胞吞噬百分比与吞噬指数等免疫学指标的影响。结果表明：2种石斛的免疫活性随多糖纯度的提高而增强，纯度最高的多糖水洗组分免疫活性最强，且各指标均显著高于对照。D. Second Love ‘Tokimeki和金钗石斛同等纯度的多糖在胸腺指数、脾脏指数、小鼠耳肿胀率及小鼠抗体积数上均无显著差异，而D. Second Love‘Tokimeki的3种不同纯度多糖的吞噬指数均达到了与金钗石斛多糖水洗组分无显著差异的水平。综合来看，栽培品种D. Second Love‘Tokimeki的多糖免疫活性与金钗石斛多糖相近，具有良好的药用开发价值。

关键词 春石斛品种；Dendrobium Second Love‘Tokimeki；金钗石斛；多糖；免疫活性

中图分类号 R282 文献标识码 A

春石斛为一类春天开花的石斛属植物，在国际花卉市场和中国年宵花市场占有重要地位。金钗石斛（Dendrobium nobile）花色艳丽，花姿优美，是观赏价值极高的春石斛原生种[1]，同时也是中国名贵中药材石斛的来源之一，为2010版《中国药典》所收载[2]，其茎含有多糖、生物碱和多种小分子物质[3-4]，而多糖作为其主要的有效成分，具有抗氧化[5]、免疫刺激活性[6]、抗肿瘤[7]和降低血糖[8]等药理作用，因过度采挖其野生资源已逐渐稀少。春石斛栽培品种的原始杂交亲本源于中国的金钗石斛等名贵药用石斛[9]，前人研究结果也表明，多数栽培品种与金钗石斛的近缘关系较近[10]，目前人工选育的栽培品种已达上万个，多以盆栽观赏为目的进行选育，而对于其药用价值的研究利用甚少。笔者发现春石斛栽培品种的茎都不同程度的含有多糖[9]，并筛选出了高多糖含量品种Dendrobium Second Love ‘Tokimeki（23.7%）。本研究在此基础上，以金钗石斛为对照，比较评估了不同纯度的D. Second Love‘Tokimeki多糖和金钗石斛多糖在免疫器官指数、迟发性变态反应、巨噬细胞吞噬功能和抗体积数等免疫学指标上的活性差异，旨在为从春石斛栽培品种中开发新的药用石斛资源提供理论和试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

春石斛Dendrobium Second Love‘Tokimeki为日本引进栽培品种，金钗石斛（Dendrobium nobile）收集于云南，二者均栽培于温室大棚内。取成熟未开花石斛茎若干，切成小段，洗净，105 ℃杀青15 min，60 ℃烘干至恒重，粉碎后过0.25 mm筛，置于干燥器中备用。试验小鼠为南方医科大学动物中心提供的昆明小鼠（20±2）g，雌雄各半。

1.2 方法

1.2.1 多糖的提取与纯化 参照笔者前期报道的方法对石斛粉末进行多糖提取和纯化[11-12]，得到春石斛品种D. Second Love‘Tokimeki的粗多糖（DHCP）、精多糖（DHPP）、多糖水洗组分（DHPP-I）及金钗石斛的粗多糖（DNCP）、精多糖（DNPP）、多糖水洗组分（DNPP-I）。

1.2.2 分组与处理 昆明小鼠环境适应3 d后，随机分为7组，即3个D. Second Love‘Tokimeki多糖组（DHCP组、DHPP组和DHPP-I组）、3个金钗石斛多糖组（DNCP组、DNPP组和DNPP-I组）及对照组（CK），每组40只。各试验组按每20 g 0.4 mL每日1次灌胃对应的多糖溶液（10 mg/mL），对照组则灌胃给予相同体积的蒸馏水。

1.2.3 免疫脏器重量的测定 每组各取昆明小鼠10只。参考张建峰等[13]的方法，连续灌胃15 d后，第16天处死小鼠，摘取脾脏和胸腺，计算脏体指数。

1.2.4 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验 每组各取昆明小鼠10只。连续灌胃10 d后，参考施子棣等[14]的方法，取鸡血于有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝固定方向摇动，脱去纤维，生理盐水洗涤3次，每次2 000 r/min离心10 min，去除上清，用生理盐水配成20%（V/V）的鸡红细胞悬液，每只小鼠腹腔注射该悬液1 mL，间隔30 min后，颈椎脫臼处死小鼠，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2 mL，转动鼠板1 min，吸出腹腔洗液1 mL，平均分滴于2片载玻片上，放入垫有湿纱布的搪瓷盒内，于37 ℃温箱孵育30 min。孵毕，置生理盐水中漂洗，除去未贴片细胞，晾干，以1 ∶ 1丙酮甲醇溶液固定，4%（V/V） Giemsa-磷酸缓冲液染色3 min，再用蒸馏水漂洗晾干。油镜下计数巨噬细胞，每张片计数100个，按下式计算吞噬百分率和吞噬指数：

吞噬百分率=（吞噬鸡红细胞的吞噬细胞数/计数的巨噬细胞数）×100%

吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞数

1.2.5 迟发性变态反应 每组各取昆明小鼠10只。连续灌胃10 d后，参考张建峰等[13]的方法，先用硫化钡在小鼠腹部皮肤约3 cm×3 cm范围内脱毛，然后用2，4-二硝基氟苯（DNFB）溶液50 μL均匀涂抹致敏。5 d后，用10 μL的DNFB溶液均匀涂抹于小鼠右耳两面进行攻击，攻击24 h后，颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳，用打孔器取下直径8 mm的耳片，分别称重，以左、右耳片重量之差为肿胀度，按如下公式计算肿胀率：

肿胀率=[（试验组-对照组）/对照组]×100%

1.2.6 血清溶血素含量测定 每组各取昆明小鼠10只。连续灌胃10 d后，从绵羊颈静脉取血，放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝一个固定方向摇动，脱去纤维，用生理盐水洗3次，每次于2 000 r/min，离心分离10 min，将积压的绵羊血红细胞用生理盐水配成2%（V/V）的细胞悬液，每只小鼠腹腔注射0.2 mL进行免疫。5 d后，摘除眼球取血于离心管内，静置1 h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，于2 000 r/min离心分离10 min，收集血清。用生理盐水将血清倍比稀释成2×、4×、8×和16×，并将不同稀释度的血清分别置于微量血凝试验板内，每孔100 μL，再加入100 μL 0.5% （V/V）的绵羊血红细胞悬液，充分混匀，装入湿润的平盘内加盖，于37 ℃温箱孵育3 h，观察血球凝集程度，参考江振友等[15]的方法计算抗体积数。

1.3 数据统计分析

数据整理采用Excel 2010软件，方差分析采用SAS 8.1软件。

2 结果与分析

2.1 石斛多糖对胸腺指数和脾脏指数的影响

不同石斛多糖处理组对胸腺指数和脾脏指数的影响见表1。金钗石斛和春石斛品种D. Second Love ‘Tokimeki均随着多糖纯度的提高，胸腺指数和脾脏指数逐渐变大，2种纯度最高的多糖水洗组分（DNPP-I和DHPP-I）均显著高于其他多糖处理和对照，D. Second Love‘Tokimeki精多糖（DHPP）的胸腺指数和脾脏指数也显著高于对照，而金钗石斛精多糖（DNPP）的胸腺指数与对照差异不显著。金钗石斛和D. Second Love‘Tokimeki相同纯度等级的多糖在胸腺指数和脾脏指数上差异不显著，而2种石斛的粗多糖（DNCP和DHCP）的这2个指标也与对照无显著差异。

2.2 石斛多糖对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的影响

由表2可看出，6种石斛多糖的吞噬百分率和吞噬指数均显著高于对照，且多糖纯度越高，效果越好。就吞噬百分率而言，品种D. Second Love ‘Tokimeki多糖DHPP-I效果最好，但与其精多糖DHPP和金钗石斛多糖DNPP-I差异不显著，2种石斛的粗多糖DOCP和DWCP相对差些。就吞噬指数而言，品种D. Second Love‘Tokimeki的3种多糖效果均较好，三者间无显著差异，且与金钗石斛多糖DNPP-I同样差异不显著，而多糖DNCP和DNPP则显著低于D. Second Love‘Tokimeki的3种多糖。

2.3 石斛多糖对2，4-二硝基氟苯诱导小鼠耳肿胀率的影响

由图1可知，随着多糖纯度的增加，小鼠耳肿胀率出现了不断增加的趋势，均显著高于对照，品种D. Second Love‘Tokimeki和金钗石斛多糖的变化趋势一致，且2种石斛同等纯度的多糖间差异不显著，以DHPP-I和DNPP-I的耳肿胀率最高，分别达47.2%和42.9%，二者显著高于其他多糖处理和对照。

2.4 石斛多糖对小鼠抗体积数的影响

由图2可看出，随着石斛多糖纯度的提高，抗体积数逐渐增大。品种D. Second Love‘Tokimeki多糖DHPP-I的抗体积数最高，金钗石斛多糖DNPP-I次之，二者间无显著差异，但均显著高于对照，而纯度相对低些的粗多糖（DHCP与DNCP）和精多糖（DHPP与DNPP）则与对照差异不显著。

3 讨论

多糖化合物作为一种免疫调节剂，能通过多种机制调节免疫细胞发挥免疫作用。一般情况下，多糖通过影响巨噬细胞、淋巴细胞、白细胞、自然杀伤细胞及RNA、DNA和蛋白质的合成等，使得机体得到免疫力的增强，也可通过影响细胞因子网络成员之间的相互作用来调节免疫力[16-17]。石斛种类较多，前人曾从不同角度对铁皮石斛[18-19]、金钗石斛[6]、霍山石斛[20]、流蘇石斛[21]和细茎石斛[22]等石斛的免疫活性进行了初步研究，其中，宋美芳等[19]发现铁皮石斛多糖和齿瓣石斛多糖高剂量组均可明显增加小鼠足趾肿胀度和脾脏指数，但各剂量组对小鼠胸腺指数无影响。金钗石斛方面，Luo等[6]发现金钗石斛水溶性多糖DNP4-2能显著增强免疫指标，促进IL-2、TNF-α和IFN-γ的分泌， 降低血清中MDA的含量。Wang等[23]也发现金钗石斛多糖（DNP-3）能明显增强T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖，提高细胞免疫活性。本研究则分析了3种不同纯度的金钗石斛水溶性多糖对昆明小鼠免疫器官指数、迟发性变态反应、巨噬细胞吞噬功能和抗体积数等免疫学指标的影响，结果发现其纯化的多糖水洗组分（DNPP-I）在上述指标上都具有较好免疫活性，与前人在金钗石斛上的结果类似。

春石斛栽培品种的多糖生物活性还未被检测和报道，与金钗石斛相比，栽培品种资源众多，在栽培上有很强的生长与抗性优势，其多糖提取纯化及药理研究对新药用石斛资源的开发具有重要意义。本研究选取了品种D. Second Love‘Tokimeki和金钗石斛比较，分别给昆明小鼠灌胃了2种石斛的粗多糖、精多糖和纯化的多糖水洗组分，发现均随着多糖纯度的增加，其免疫活性越强，这与金钗石斛多糖、铁皮石斛多糖和大苞鞘石斛多糖在抗氧化活性上的趋势是一致的[11]。D. Second Love ‘Tokimeki和金钗石斛同等纯度的多糖在胸腺指数、脾脏指数、2，4-二硝基氟苯诱导的小鼠耳肿胀率及小鼠抗体积数这些指标上均无显著差异，仅在小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞吞噬指数和吞噬百分率上存在显著差异，即D. Second Love‘Tokimeki的3种不同纯度多糖（DHCP，DHPP和DHPP-I）的吞噬指数均达到与金钗石斛多糖（DNPP-I）差异不显著的水平，且均显著高于金钗石斛多糖（DNPP与DNCP）和对照，而D. Second Love ‘Tokimeki多糖（DHPP）的吞噬百分率同样显著高于同等纯度的金钗石斛多糖（DNPP），且与纯度最高的DHPP-I和DNPP-I差异不显著。可见，D. Second Love ‘Tokimeki多糖石斛对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的作用要略优于金钗石斛。

综上所述，春石斛栽培品种D. Second Love ‘Tokimeki多糖能显著提高昆明小鼠的免疫器官指数、迟发性变态反应、巨噬细胞吞噬功能和抗体积数等免疫学指标，整体上与金钗石斛多糖的免疫功能相当，而在对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的作用要略优于金钗石斛多糖，这为新的药用石斛资源挖掘和石斛资源的创新利用提供了新的切入点，而该品种多糖是否具有其他药理活性则有待于进一步研究。

参考文献

[1] 王 琳， 叶庆生， 刘 伟. 金钗石斛研究概况[J]. 亚热带植物科学， 2004， 33（2）： 73-76.

[2] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典（第二部）[M]. 北京： 中国医药科技出版社， 2010： 85-87.

[3] Xu J， Han Q B， Li S L， et al. Chemistry，bioactivity and quality control of Dendrobium， a commonly used tonic herb in traditional Chinese medicine[J]. Phytochem Rev， 2013， 12（2）：341-367.

[4] Ng T B， Liu J Y， Wong J H， et al. Review of research on Dendrobium， a prized folk medicine[J]. Appl Microbiol Biot，2012， 93（5）： 1 795-1 803.

[5] Luo A X， He X J， Zhou S D， et al. In vitro antioxidant activities of a water-soluble polysaccharide derived from Dendrobium nobile Lindl. Extracts[J]. Int J Biol Macromol，2009， 45（4）： 359-363.

[6] Luo A X， Fan Y J. Immune stimulating activity of water-soluble polysaccharide fractions from Dendrobium nobile Lindl[J]. Afr J Pharm Pharmaco， 2011， 5（5）： 625-631.

[7] Wang J H， Luo J P， Zha X Q， et al. Comparison of antitumor activities of different polysaccharide fractions from the stems of Dendrobium nobile Lindl[J]. Carbohyd Polym，2010， 79（1）： 114-118.

[8] 蔡 偉， 张宏桂， 刘朋朋，等. 金钗石斛水提物对链脲霉素高血糖小鼠的降血糖作用研究[J]. 中医药学报， 2013， 41（4）：15-17.

[9] 章金辉， 操君喜， 朱根发，等. 春石斛杂交种多糖及生物碱含量比较研究[J]. 热带作物学报， 2013， 34（4）： 727-731.

[10] Zhu G F， Li D M. Genetic relationships among native species and hybrid cultivars of Asian Dendrobium（Orchidaceae）using amplified fragment length polymorphism markers[J]. Hortscience， 2011， 46（1） ：192-196.

[11] 王再花， 章金辉， 李 杰， 等. 3种药用石斛多糖的抗氧化活性比较研究[J]. 华南师范大学学报（自然科学版）， 2015， 47（5）： 65-70.

[12] Sun Y D， Wang Z H， Ye Q S. Composition analysis and anti-proliferation activity of polysaccharides from Dendrobium chrysotoxum[J]， Int J Biol Macromol， 2013， 62（1）： 291-295.

[13] 张建峰， 昌友权， 陈 光，等. 红曲多糖的免疫活性研究[J]. 食品科学， 2008， 29（2）： 391-393.

[14] 施子棣， 何季芬， 张桂兰，等. 金钗石解水煎液时小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能影响的实验观察[J]. 河南中医， 1989， 2（1）： 35-36.

[15] 江振友， 林 晨， 刘小澄，等. 灵芝多糖对小鼠体液免疫功能的影响[J]. 暨南大学学报， 2003， 24（2）： 51-53.

[16] Ohri C M， Shikotra A， Green R H， et al. Tumour necrosis factor-alpha expression in tumour islets confers a survival advantage in non-small cell lung cancer[J]. BMC Cancer，2010， 323（10）： 1 186-1 192.

[17] Bermudez L E， Stevens P， Kolonoski P， et al. Treatment of experimental disseminated Mycobacterium avium complex infection in mice with recombinant IL-2 and tumor necrosis factor[J]. J Immunol， 1989， 143（9）： 2 996-3 000.

[18] Xia L J， Liu X F， Guo H Y， et al. Partial characterization and immunomodulatory activity of polysaccharides from the stem of Dendrobium officinale（Tiepishihu）in vitro[J]. J Funct Foods， 2012， 4（1）： 294-301.

[19] 宋美芳， 李 光， 陈 曦，等. 两种石斛多糖提高小鼠免疫活性的初步研究[J]. 中国药学杂志， 2013， 48（6）： 428-431.

[20] Zha X Q， Zhao H W， Bansal V， et al. Immunoregulatory activities of Dendrobium huoshanense polysaccharides in mouse intestine， spleen and liver[J]. Int J Biol Macromol， 2014， 64（2）： 377-382.

[21] 张 展. 流苏石斛多糖分离纯化、结构分析及免疫活性研究[D]. 合肥： 合肥工业大学， 2013.

[22] 陈璋辉， 陈云龙， 吴 涛， 等. 细茎石斛多糖DMP4a-1的结构特性及免疫活性研究[J]. 中国药学杂志， 2005， 40（23）： 1 781-1 783.

[23] Wang J H， Luo J P， Yang X F， et al. Structural analysis of a rhamnoarabinogalactan from the stems of Dendrobium nobile Lindl.[J]. Food Chem， 2010， 122（3）： 572-576.