黄柏水提物联合抗菌药对产ESBLs大肠杆菌的抑菌效果

徐素萍　刘增援　吴永继　梁政　潘婕　孙燕杰　宋剑武　黄凯　司红彬

摘要：【目的】探讨黄柏水提物与抗菌药联用对产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）大肠杆菌的抑制效果，为黄柏的综合开发利用提供参考依据。【方法】采用二倍微量肉汤稀释法测定黄柏水提物与抗菌药的最小抑菌浓度（MIC），并采用微量棋盘稀释法测定黄柏水提物与抗菌药联用后的分级抑菌浓度指数（FICI）。【结果】黄柏水提物对产ESBLs大肠杆菌的MIC为500 mg/mL，黄柏水提物与头孢曲松钠、阿莫西林、痢菌净、磺胺间甲氧嘧啶、头孢噻呋钠、头孢他啶、氟苯尼考、环丙沙星、诺氟沙星、左旋氧氟沙星、克林沙星、加替沙星、头孢噻肟联用后的FICI为0.50～2.01，其中，黄柏水提物与阿莫西林、头孢曲松钠、头孢噻呋钠、头孢他啶、头孢噻肟、痢菌净联用存在相加作用，与氟苯尼考联用存在协同作用，与诺氟沙星、左旋氧氟沙星、克林沙星、磺胺间甲氧嘧啶间为无关作用，与环丙沙星、加替沙星联用呈拮抗作用。【结论】黄柏水提物与青霉素类、第三代头孢菌素、痢菌净、氟苯尼考联用是通过相加或协同作用提高药物对产ESBLs大肠杆菌的抑制效果，但不宜与喹诺酮类抗菌药联合用药。

关键词： 黄柏；抗菌药；产ESBLs大肠杆菌；联合用药；微量棋盘稀释法；FICI

中图分类号： S853.74 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）03-0500-06

0 引言

【研究意义】由于抗生素的不合理使用，导致产超广谱β-内酰胺酶（Extended spectrum-lactamases，ESBLs）细菌广泛流行（吴英等，2013）。耐药性大肠杆菌的主要机制为大肠杆菌产生ESBLs，而ESBLs是由质粒介导的一种能水解氧亚胺头孢菌素类、单环内酰胺类和青霉素类的β-內酰胺酶，对青霉素类、第三代头孢菌素、单环β-内酰胺类抗生素均呈耐药性（马冬雪等，2010）。产ESBLs菌在大肠杆菌中分布广泛，以其耐药性强、水解底物广、易传播等特点备受关注，且引起的畜禽感染发病给临床药物治疗带来极大困难。因此，寻找对产ESBLs大肠杆菌作用效果明显的中药，研制出廉价高效的抗菌新药物，对防治该菌引起的疾病具有重要意义。【前人研究进展】梁莹（2005）采用体外抑菌试验测定黄柏对大肠杆菌抑制作用，结果显示，黄柏对大肠杆菌作用效果较小，大肠杆菌在反应管中均长出细菌，测试为阳性。赵晶晶等（2012）的研究结果表明，黄柏可有效提高点带石斑鱼嗜中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞的数量，从而增强机体非特异性免疫。李敬峰等（2013）研究表明，复方黄柏液保留灌肠治疗溃疡性结肠炎具有良好的疗效。关于中西药联合用药对产ESBLs细菌抑制作用的研究也有一些文献报道，何明等（2010）研究表明，清开灵注射剂和双黄连粉剂分别联合头孢—舒巴坦钠，具有协同作用，可增强合头孢—舒巴坦钠对产ESBLs大肠杆菌的敏感性；罗芬芳（2013）的研究结果表明，黄藤素、没食子酸分别联合β-内酰胺类抗生素，可明显抑制产ESBLs大肠杆菌的生长。【本研究切入点】黄柏资源丰富，具有免疫抑制（邱全瑛等，1996）、减压强心（李峰和贾彦竹，2004）、抗真菌（刘春平等，2005）、抗活螨（张荣波等，2006）、抗炎（贾红慧等，2007）等作用，其提取物对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、甲型链球菌、乙型链球菌、变形杆菌有明显的抑菌作用（陈蕾和邸大琳，2006），但目前将黄柏水提物联合抗菌药应用于抑制产ESBLs大肠杆菌的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】探讨黄柏水提物与抗菌药联用对产ESBLs大肠杆菌的抑制效果，采用微量棋盘稀释法测定两者联用后的部分抑菌浓度指数（FICI），判定抗菌活性是否明显增强，是否存在协同或相加作用，为黄柏的综合开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

黄柏购自广西万丰药业有限公司。头孢曲松钠、头孢噻呋钠、头孢他啶、阿莫西林、环丙沙星、诺氟沙星、左旋氧氟沙星、克林沙星、加替沙星、痢菌净、磺胺间甲氧嘧啶、氟苯尼考、头孢噻肟、克拉维酸均在质量有效期内。MH肉汤、MH琼脂、普通琼脂、麦康凯琼脂、SS琼脂、营养肉汤、三糖铁琼脂、细菌生化微量鉴定管、V-P试剂、M.R.试剂、吲哚试剂均购自杭州天和微生物试剂有限公司。菌种由广西大学临床中兽医实验室分离并鉴定。

1. 2 菌株分离鉴定

无菌采集病猪病料，分别接种于麦康凯琼脂板和SS琼脂培养基上，37 ℃培养16～18 h，挑取可疑菌落接种于营养肉汤培养基，37 ℃培养16～18 h；再将菌液分别接种于麦康凯琼脂培养基上纯化多次后，对疑似细菌进行革兰氏染色、镜检；然后用生化鉴定管对纯化后的细菌进行生化鉴定，同时对分离菌株进行三糖铁（TSI）、糖发酵、IMViC、明胶液化等试验。

1. 3 产ESBLs大肠杆菌检测

按美国临床实验室标准化协会（CLSI）推荐的ESBLs标准纸片扩散法进行初筛试验。检测受试菌的抑菌环直径是否满足头孢他啶（30 μg/片）≤22 mm、氨曲南（30 μg/片）≤27 mm、头孢噻肟（30 μg/片）≤27 mm、头孢曲松（30 μg/片）≤25 mm，满足上述抑菌环要求的受试菌有可能产ESBLs，再对初筛出的菌株进行表型确证试验。若头孢他啶与头孢噻肟两种药物中有任何一种在添加克拉维酸后，抑菌环直径与不添加克拉维酸的抑菌环直径相比，增大值≥5 mm时，即可判定为产ESBLs菌株。

1. 4 产ESBLs基因型检测

参照GenBank中的TEM、SHV、CTX-M、OXA、FosA3基因序列，分别设计其通用引物（表1）并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反应体系为25.00 μL，即模板DNA 2.00 μL，上、下游引物各1.00 μL，10×Easy Taq Buffer 2.50 μL，High Pure dNTPs 0.50 μL，Easy Taq DNA合成酶0.25 μL，加去离子水至25.00 μL。扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，在各退火温度（TEM 52.5 ℃，OXA 52.5 ℃，SHV 56.5 ℃，CTX-M 55.0 ℃，FosA3 55.0 ℃）下退火30 s，72 ℃ 1 min，共进行30个循环；最后72 ℃延伸10 min。以纯水作空白对照组。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，核酸染液染色在凝胶成像系统上观察电泳结果。扩增产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，再利用BLAST（NCBI）对所得的基因序列进行对比分析。

1. 5 黄柏水提物制备及抗菌药物处理

取黄柏干燥粗粉100 g，加入10倍量的蒸馏水浸泡过夜，大火煮至沸腾后文火保持30 min，过滤收集滤液。再依次加8倍量与6倍量的水反复提取2次，合并3次滤液，浓缩至100 mL，此时药物浓度为1 g/mL，高压分装至50 mL离心管，-20 ℃冰箱保存备用。用无菌蒸馏水将抗菌药配制成6400 μg/mL，氟苯尼考配制成5120 μg/mL，-20 ℃保存备用。

1. 6 单药最小抑菌浓度（MIC）测定

取培养好的菌液，以高压过的MH肉汤采用二倍微量肉汤稀释法测定黄柏水提物及各抗菌药的MIC，并记录。

1. 7 黄柏水提物与抗菌药体外联合药敏试验

黄柏水提物及各抗菌药采用微量方阵棋盘法设计（王爽等，2014），调整菌液浓度为1×106 CFU/mL，接种于96孔无菌培养板，在纵横两个方向上对两种药物分别进行倍比稀释，微量振荡器振荡，37 ℃下培养16～18 h，观察黄柏水提物与抗菌药联用对产ESBLs大肠埃希菌的MIC，以无菌生长孔的最低药物浓度为MIC，并计算分级抑菌浓度指数（FICI）。计算公式如下：

联合用药判读：FICI≤0.50为协同作用，0.502.00为拮抗作用（陈广灿等，2011）。

2 结果与分析

2. 1 细菌分离鉴定结果

菌株在麦康凯琼脂培养基上形成玫瑰红色、表面光滑的圆形菌落；在SS琼脂培养基上形成红色、半透明的圆形菌落；在普通琼脂培养基上形成灰白色隆起、濕润、光滑、直径1～3 mm的菌落。该分离菌在三糖铁培养基的斜面和底层产酸，不产H2S，不产气；在葡萄糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖培养基中，产酸产气；不分解肌醇和尿素；V-P试验阴性；M.R.试验阳性；枸橼酸盐利用试验阴性，无液化明胶。经鉴定，该分离菌为大肠杆菌。

2. 2 菌株表征鉴定结果

对分离菌株进行初筛，发现头孢曲松、头孢他啶、头孢噻肟、氨曲南的抑菌圈直径分别为14、16、17和14 mm，均符合判断标准，说明该菌株为产ESBLs可疑菌株。对该菌株进行表征确证试验，由表2可知，头孢噻肟与头孢噻肟/克拉维酸抑菌圈直径之间相差5 mm，根据标准确定该分离菌株产ESBLs。

2. 3 产ESBLs大肠杆菌检测结果

以TEM、SHV、CTX-M引物进行扩增，PCR检测结果（图1）显示，得到TEM基因片段大小为520 bp、CTX-M基因片段大小为898 bp的条带，不含SHV基因，表明产ESBLs大肠杆菌携带TEM和CTX-M基因。经BLAST（NCBI）比对发现，该菌株所含的TEM基因型与KM598665.1的同源性为100%，CTX-M基因型与KC121030.1的同源性为99%。

2. 3 黄柏水提物与抗菌药MIC测定结果

采用二倍微量肉汤稀释法测得黄柏水提物的MIC为500 mg/mL，各抗菌药的MIC见表3。由表3可知，头孢曲松钠、阿莫西林、痢菌净、磺胺间甲氧嘧啶、头孢噻呋钠、头孢他啶、氟苯尼考、环丙沙星、诺氟沙星、左旋氧氟沙星、克林沙星、加替沙星和头孢噻肟对ESBLs大肠杆菌的MIC较高，说明产ESBLs细菌对这些药物不敏感。

2. 4 黄柏水提物与抗菌药体外联合药敏试验结果

由表4可知，黄柏水提物与阿莫西林、头孢曲松钠的FICI=1.00，与头孢他啶、头孢噻呋钠、头孢噻肟、痢菌净的FICI=0.75，与氟苯尼考的FICI=0.50，与诺氟沙星、左旋氧氟沙星、克林沙星、磺胺间甲氧嘧啶的FICI为1.02～1.03，与环丙沙星、加替沙星的FICI>2.00。表明黄柏水提物联合阿莫西林、头孢曲松钠、头孢噻呋钠、头孢他啶、头孢噻肟、痢菌净的体外抗菌活性明显增强，呈相加作用；黄柏水提物与氟苯尼考联用呈协同作用；黄柏水提物与诺氟沙星、左旋氧氟沙星、克林沙星、磺胺间甲氧嘧啶联用效果不明显，为无关作用；黄柏水提物与环丙沙星、加替沙星联用呈拮抗作用。

3 讨论

本研究结果表明，黄柏水提物与部分抗菌药联合后，对产ESBLs大肠杆菌有抑制作用，其中黄柏水提物与氟苯尼考联用存在协同作用，与青霉素类、第三代头孢菌素、痢菌净联用存在相加作用。青霉素类药物对产ESBLs的大肠杆菌不敏感，但与黄柏水提物联合诱导后，其抗菌效果明显加强，从而对产ESBLs大肠杆菌起到抑菌作用。说明黄柏水提物中含有能与青霉素类、氟苯尼考产生相加或协同作用的有效成分，可增强抑菌效果，具体成分和抑菌机理有待进一步鉴定及研究。中西药联用可减少用药量，增强药效，但一些中药与西药联合使用后会降低西药疗效，如本研究中黄柏水提物与克林沙星联用后对大肠杆菌的抑制效果降低。黄柏的有效成分含有生物碱类，包括小檗碱、黄柏碱、木兰碱、药根碱等，黄柏水提物呈弱碱性，与喹诺酮类药物联用会降低或消除喹诺酮类药物疗效（金建玲等，2011；刘红英和孙玉杰，2013）。本研究中，黄柏水提物与喹诺酮类药物（诺氟沙星、左旋氧氟沙星、克林沙星、环丙沙星、加替沙星）的联合效果不明显甚至呈拮抗作用，与上述的前人研究结果一致。

由于抗菌药的滥用导致大肠杆菌对一些抗菌药产生耐药性，其中产ESBLs大肠杆菌是目前较常见的一种耐药菌。寻找对产ESBLs大肠杆菌作用效果明显的中药，研制出廉价高效抗菌新药物是今后研究趋势。中西药联用能否提高抗菌效果、降低抗菌药物耐药性极具研究价值。本研究的体外抑菌效果说明黄柏水提物与部分抗菌药联用对产ESBLs大肠杆菌具有一定的协同或相加作用，并证实喹诺酮类药物与偏碱性中药存在配伍禁忌，可为临床研发出治疗耐药菌、超级菌的新药物提供依据。本研究采用体外抑菌试验，但药物在体内的作用机制较体外复杂，黄柏水提物与抗菌药联合使用是否在体内具有相同的效果还需进一步探究。中药成分联合抗菌药使用，既能减少药品用量、提高治疗效果，又可减少不良反应现象，甚至能够逆转细菌对一些抗生素的耐药性（王静和张淑文，2007），对于开发新型抗菌剂尤其是抗耐药菌药物是一条有效途径，可成为治疗产ESBLs细菌感染的一个新方向。此外，对中西药联用的研究及筛选出具有良好抑菌效果的中药，进行合理的配伍作用，也将是今后的研究热点。

4 结论

黄柏水提物与青霉素类、第三代头孢菌素、痢菌净、氟苯尼考联用是通过相加或协同作用提高药物对产ESBLs大肠杆菌的抑制效果，但不宜与喹诺酮类抗菌药联合用药。

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（责任编辑 罗 丽）