凡纳滨对虾苗空肠空胃病原的分离鉴定及药敏试验

张彬　何苹萍　黄婷　陈福艳　谢达祥　陈晓汉

摘要：【目的】对伴有空肠空胃症状的发病凡纳滨对虾苗进行病原分离鉴定及药敏试验，为有效防治对虾早期死亡综合症（EMS）及开展相关领域研究提供基础资料。【方法】以常规方法进行患病虾苗病原菌分离，通过透射电镜观察、Vitek 2 GN全自动细菌鉴定系统及16S rRNA序列扩增等进行病原菌鉴定，并以K-B纸片扩散法进行药敏试验。【结果】从患病虾苗中分离获得2株优势菌株（HTW140601和HTW140602），根据分离菌株的菌体形态、生理生化特性及16S rDNA序列分析结果，分别判定为鲍希瓦氏菌（Shewanella haliotis）和创伤弧菌（Vibrio vulnificus）。菌株HTW140601和HTW140602对头孢曲松、庆大霉素、氧氟沙星均表现出高度敏感。【结论】创伤弧菌是引起凡纳滨对虾苗空肠空胃的致病菌，实际生产中可选用头孢曲松、庆大霉素、氧氟沙星进行防治。

关键词： 凡纳滨对虾；虾苗；创伤弧菌；鲍希瓦氏菌；分离鉴定；药敏试验

中图分类号： S945.46 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）03-0506-05

0 引言

【研究意义】凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）是迄今世界上养殖产量最高的优良虾种，但随着对虾集约化养殖的发展，各种疾病频繁发生已成为影响对虾养殖业的主要因素。高健康虾苗是对虾养殖成功的重要保障之一，因此，研究引发虾苗病害的病原及其防治措施，对促进我国对虾集约化养殖的健康发展具有重要意义。【前人研究进展】近年来，对虾早期死亡综合症（Early mortality syndrome，EMS）在全球各地肆行。该病在我国已成为对虾养殖早期高死亡率、高排塘的主要原因，致使对虾产业承受重大损失（周胜锰，2013）。凡纳滨对虾EMS又称为急性肝胰腺坏死症（Acute hepatopancreatic necrosis syndrome，AHPNS），多发生在养殖期30 d内，病虾体色白浊并微红，肝胰腺肿大、呈淡白或淡黄色，最后萎缩。发病对虾在水面游动或趴伏在塘边，胃空肠空，病情发展迅速，在我国通常被称为偷死病（文国樑等，2015）。目前，美国、泰国、印度等国家将凡纳滨对虾EMS病原认定为副溶血弧菌或变种的副溶血弧菌（Joshi et al.，2014；Kumar et al.，2014；Jee et al.，2015），而国内对于该病病原的研究尚无定论，仍处于初步研究阶段。刘群等（2014）从疑似患EMS的对虾中检测出黄头病毒（Yellow-head virus，YHV）的一种新株型。黄志坚等（2016）研究表明，对虾EMS不是由单一病毒所引起，而且与水体理化因子（氨氮、亚硝酸盐等）密切相关，尤其在氨氮和亞硝酸盐浓度较高的养殖池塘容易暴发EMS。【本研究切入点】空肠空胃是对虾EMS的主要症状，因此对引起虾苗空肠空胃的病原菌进行鉴别研究是确保高健康虾苗生产的前提，但目前国内鲜见相关报道。【拟解决的关键问题】对伴有空肠空胃症状的发病凡纳滨对虾苗进行病原分离鉴定及药敏试验，旨在为有效防治对虾EMS及开展相关领域研究提供基础资料。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

患病凡纳滨对虾苗来自广西某虾苗场；TCBS、TSA、TSB培养基购自北京陆桥技术股份有限公司；细菌药物敏感纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司；2×Tap PCR Master Mix、细菌DNA提取试剂盒、离心柱型普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；扩增引物由上海英骏生物技术有限公司合成，其中16S rRNA引物序列为16S rRNA1（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和16S rRNA2（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。

1. 2 病症观察

与正常虾苗个体相比，观察患病虾苗的发病症状，包括肝胰腺、肠道及内容物、腹节肌肉等。

1. 3 病原菌分离

用无菌纱布收集虾苗，灭菌生理盐水清洗数次，转入无菌EP管中匀浆，6000 r/min离心后取上清液，以生理盐水进行10～1000倍梯度稀释，将不同稀释倍数的上清液涂布于TCBS培养基上，28 ℃培养16～24 h后取出观察菌落生长情况。将培养获得的菌落进行纯化，挑取单个菌落接种至TSB培养基，部分菌液4 ℃保存备用。

1. 4 分离菌株培养特性及其形态电镜观察

28 ℃培养24 h后取出TCBS培养基进行肉眼观察，同时用pH 7.2磷钨酸进行负染色，制备超薄切片，于透射电镜下观察并拍照。

1. 5 生化特性鉴定

通过Vitek 2 GN全自动细菌鉴定系统进行生化特性鉴定。

1. 6 16S rDNA序列测定分析

用细菌DNA提取试剂盒对菌液中的DNA进行提取，以16S rRNA为靶序列的PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 50 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，进行35个循环；最后72 ℃延伸10 min。取PCR产物于1%琼脂糖凝胶中电泳，在紫外透射仪下将含目的条带的琼脂糖凝胶切下，利用离心柱型普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收，回收产物送至上海英骏生物技术有限公司进行测序。将测序得到的序列与NCBI网站GenBank中的核酸数据进行BLAST分析，选取同源性最高的序列及几种模式弧菌16S rRNA，采用DNASTAR软件构建系统发育进化树。

1. 7 药敏试验

以K-B纸片扩散法进行病原菌的药敏试验。取过夜培养的菌液200 μL均匀涂布于TSA培养基上，待菌液吸附5 min后用无菌镊子将各种抗菌药物圆形纸片分别贴于培养基表面，30 ℃培养20 h后观察结果。根据药物纸片周围有无抑菌圈及抑菌圈直径判断该菌对各种药物的敏感性。

2 结果与分析

2. 1 患病虾苗症状

患病苗池中的凡纳滨对虾苗出现浮头、游池现象，患病虾苗临床症状均表现为肝胰腺颜色变淡，部分出现萎缩，空肠空胃，有些腹节肌肉略微白浊（图1）。

2. 2 分离菌培养特性及菌体形态

从患病虾苗中分离获得2株优势菌株，分别命名为HTW140601和HTW140602。菌株HTW140601在TCBS培养基上，其菌落呈绿色（图2-a）；负染电镜下菌株HTW140601呈杆状（图3-a），极生单鞭毛。菌株HTW140602在TCBS培养基上呈黄色（图2-b），革兰氏染色呈阴性；负染电镜下菌株HTW140602呈短杆状（图3-b），两端钝圆，极生单鞭毛。

2. 3 分离菌生理生化鉴定结果

由表1可知，菌株HTW140601对谷氨酰芳胺酶、鸟氨酸脱羧酶和磷酸酶呈阳性反应，对D-葡萄糖、蔗糖发酵等呈阴性反应；菌株HTW140602对D-葡萄糖、蔗糖发酵等呈阳性反应，对谷氨酰芳胺酶、鸟氨酸脱羧酶等呈阴性反应。

2. 4 16S rDNA序列比对分析结果

对菌株HTW140601和HTW140602进行测序，结果表明，其16S rDNA序列分别为1468和1480 bp。采用GenBank进行BLAST相似性搜索比对，发现菌株HTW140601与鲍希瓦氏菌（SS263-N4）的相似度最高，而菌株HTW140602与创伤弧菌（JQ307112.1）的相似度最高，其对应的同源性分别为99.0%和98.0%。运用DNASTAR构建系统发育进化树（图5），并结合生化鉴定结果可认定分离获得的2株优势菌株（HTW140601和HTW140602）分别为鲍希瓦氏菌（Shewanella haliotis）和创伤弧菌（Vibrio vulnificus）。

2. 5 药敏试验结果

由表2可知，在18种药物中，菌株HTW140601对卡那霉素、阿莫西林、利福平、恩诺沙星、头孢曲松、头孢哌酮、庆大霉素、氧氟沙星、诺氟沙星、头孢克洛、头孢唑啉等11种药物表现高度敏感，对头孢克肟、林可霉素、复方新诺明、罗红霉素4种药物呈耐药性；菌株HTW140602对罗红霉素、头孢曲松、庆大霉素、氧氟沙星4种药物表现高度敏感，而对头孢克肟、林可霉素、阿莫西林、复方新诺明、羧苄青霉素、氨曲南、利福平、头孢哌酮、诺氟沙星、头孢唑啉10种药物呈耐药性。

3 讨论

目前，关于对虾空肠空胃病原的研究尚无定论。国内外学者进行了多种病原筛查，发现虽然能从患病对虾中分离获得有致病力的副溶血弧菌等细菌性病原（张宝存等，2012），但病理学和人工感染试验结果表明细菌感染属于继发感染（Flegel，2012；Lightner et al.，2012）。此外，由于放苗密度過高、养殖水质变差、弧菌大量繁殖、虾苗肠道菌群比例失调、肝胰腺消化功能紊乱、虾苗不摄食或摄食过少，也可能造成对虾虾苗空肠空胃。本研究结果表明，从患病虾苗体内分离获得的优势菌为鲍希瓦氏菌和创伤弧菌，其中，创伤弧菌（菌株HTW140602）是导致虾苗空肠空胃的病原，但其致病性有待进一步验证；而鲍希瓦氏菌（菌株HTW140601）可能是作为肠道内优势菌群存在，其依据是国内外至今尚无鲍希瓦氏菌感染凡纳滨对虾的相关报道，但有利用该菌作为对虾肠道益生菌抑制病原弧菌增殖的研究报道（Hao et al.，2014）。

本课题组曾对凡纳滨对虾苗种繁育各环节水体中弧菌数量和优势菌群进行分析，发现在各繁育环节水体中均以溶藻弧菌为优势菌群，而本研究从患病虾苗体内分离获得的优势弧菌为创伤弧菌，说明水体中的优势弧菌未必是致病菌。创伤弧菌广泛存在于近海及河口环境中，从牡蛎、蛤、螃蟹、扇贝、虾、鱼等水产动物及浮游生物沉积物中均可分离获得此菌，是水产养殖中危害较大的一种细菌性病原（Biosca et al.，1991；Vinh et al.，2006；Sharshar and Azab，2008；黎炯等，2011）。因此，生产上定期监测养虾池中弧菌的数量变化对预防虾病发生具有重要意义，尤其是苗种繁育后期和放苗前。虾苗培育过程是个多因素的复杂系统，要取得对虾苗种繁育的成功，不仅要控制弧菌数量，还必须控制好放苗密度、饵料投喂量、有毒藻类的繁殖，保持良好的水质，预防病原繁殖扩散。

抗生素滥用致使细菌产生了越来越广泛的耐药性，现已危害到水产养殖系统的生物安全（张宝存等，2012）。本研究的药敏试验结果表明，鲍希瓦氏菌（菌株HTW140601）对卡那霉素、阿莫西林、利福平、恩诺沙星、头孢曲松、头孢哌酮、庆大霉素、氧氟沙星、诺氟沙星、头孢克洛、头孢唑啉11种药物表现出高度敏感，创伤弧菌（菌株HTW140602）仅对罗红霉素、头孢曲松、庆大霉素、氧氟沙星4种药物表现出高度敏感。综合2株分离菌株的药敏性，可选用头孢曲松、庆大霉素、氧氟沙星3种药物进行防治。

4 结论

创伤弧菌是引起凡纳滨对虾苗空肠空胃的致病菌，而鲍希瓦氏菌是作为肠道内优势菌群存在，实际生产中可选用头孢曲松、庆大霉素、氧氟沙星进行防治。

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（責任编辑 兰宗宝）