四重PCR检测抗除草剂转基因油菜T45

李忆 尹全 刘勇

摘要：【目的】建立多重PCR检测抗除草剂转基因油菜T45的方法，为其转基因检测提供技术支持。【方法】选择油菜内源参照基因CruA、外源基因P-CaMV 35S、T-CaMV 35S和pat作为四重PCR检测基因，特异性引物序列参照国家相关标准或文献，通过对多重PCR退火温度和引物浓度的优化、灵敏度测试及已知样品验证，建立抗除草剂转基因油菜T45多重PCR检测体系。【结果】多重PCR的适宜退火温度为58 ℃，适宜引物终浓度（μmol/L）配比CruA∶P-CaMV 35S∶T-CaMV 35S∶pat为0.1∶0.2∶0.2∶0.2，方法灵敏度为0.01 ng/μL，所有已知样品的扩增条带与其分子特征显示的外源基因元件完全一致。【结论】建立的抗除草剂转基因油菜T45品系四重PCR检测方法可实现在一个反应体系中同时检测抗除草剂转基因油菜T45内源参照基因和多个外源基因成分，为转基因油菜T45提供了一种有效的检测手段。

关键词： 油菜；多重PCR；毛细管电泳；分子检测

中图分类号： S565.4 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）06-0883-06

0 引言

【研究意义】抗除草剂转基因油菜T45由德国拜耳公司研发，其转入基因表达抗草铵膦除草剂的活性成分。T45品系已先后在澳大利亚、加拿大、日本和美国被批准环境释放，并在我国、欧盟、韩国等8个国家和地区被批准用于食品或饲料加工原料。油菜籽是我国重要的食用植物油原料和饲料蛋白源，但由于供给长期处于短缺状态，我国每年进口油菜籽达千万吨，其中60%以上为转基因油菜籽（张丽等，2012）。除抗除草剂转基因油菜T45外，我国还允许抗虫转基因油菜GT73、MS1等9个转基因油菜品系进口用作加工原料。随着转基因商业化产品不断增多，其安全性問题受到社会各界的广泛关注，许多国家和地区制定并实施了相关转基因产品标识制度（金芜军等，2004），而转基因标识制度的科学执行就必须依托快速、有效的转基因产品检测技术。因此，建立快速、有效的转基因检测体系对提高检测效率和降低检测成本及加强转基因产品安全管理均具有重要意义。【前人研究进展】目前，转基因特异PCR检测有4个不同的策略，包括筛选检测、基因特异检测、结构特异检测和转化事件特异检测。Yang等（2006）通过TAIL-PCR克隆找到了T45油菜5'端寄主植物的DNA与转化载体间的连接序列，再利用转化事件特异检测策略分别建立了定性和定量检测抗除草剂转基因油菜T45方法。聂淑晶（2008）通过基因组步移文库建立，分离T45油菜左边界（3'端）及右边界（5'端）寄主植物的DNA与转化载体间的连接序列，再利用转化事件特异检测策略分别建立了左边界和右边界的定性和定量检测抗除草剂转基因油菜T45方法。申爱娟等（2014）应用温度不对称PCR（TAIL-PCR）扩增获得转基因油菜W-4 T-DNA插入位点的左、右旁侧序列，依据左、右边界旁侧序列和转基因载体的T-DNA左右边界序列设计2对特异性引物TLF/TLR和TRF/TRR，从W-4基因组DNA中扩增出大小分别为485和405 bp的预期产物，据此建立了W-4的转基因事件特异性PCR检测技术。多重PCR在转基因检测方面的应用也非常广泛，白月等（2011）用复合PCR结合DHPLC检测了番茄中的转基因成分，建立的多重PCR-DHPLC操作简便，快速准确，能够同时检测转基因番茄4个内、外源基因，检测限达0.5 ng/μL；何玮玲等（2012）利用多重 PCR建立了食品中 4种肉类成分的快速鉴别方法；崔学强等（2015）建立了多重PCR鉴定伤口中3种致病菌的方法。【本研究切入点】目前，多重PCR结合毛细管电泳技术在转基因玉米及食品转基因成分检测中已有相关研究，但在转基因油菜T45检测方面未见报道。虽然相关文献报道和国家标准中已有抗除草剂转基因油菜T45转化事件特异检测方法，但尚未见针对转化事件中的多个外源基因进行多重PCR并结合毛细管电泳检测的技术方法。【拟解决的关键问题】根据抗除草剂转基因油菜T45插入的基因元件，拟建立一种包括油菜内源参照基因CruA、外源基因P-CaMV 35S、T-CaMV 35S和pat的四重PCR检测技术体系，通过对多重PCR体系的退火温度、4对引物终浓度配比及方法灵敏度进行优化，并利用已知样品对检测体系进行验证，为抗除草剂转基因油菜T45检测提供技术支持。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

试验用转基因油菜籽T45粉末（含CruA、P-CaMV 35S、T-CaMV 35S和pat基因）、转基因大豆GTS40-3-2种子粉末（含P-CaMV 35S基因，不含CruA、T-CaMV 35S和pat基因）、转基因玉米Bt11种子粉末（含P-CaMV 35S和pat基因，不含CruA和T-CaMV 35S基因）、转基因油菜籽GT73粉末（含CruA基因，不含P-CaMV 35S、T-CaMV 35S和pat基因）、转基因油菜籽MS8粉末（含CruA基因，不含P-CaMV 35S、T-CaMV 35S和pat基因）、转基因水稻TT51-1种子粉末（不含CruA、P-CaMV 35S、T-CaMV 35S和pat基因）均由四川省农业科学院质量标准与检测技术研究所保存并提供。植物基因组提取试剂盒、标准分子量（M）购自天根生化科技（北京）有限公司；Master Mix购自日本东洋纺（TOYOBO）株式会社；引物由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。

1. 2 引物序列

依据抗除草剂转基因油菜T45的分子特征信息，选择油菜内源参照基因CruA、外源基因P-CaMV 35S、T-CaMV 35S和pat作为四重PCR技术体系的检测基因，特异性引物序列参照国家相关标准（表1）。将各条引物浓度稀释至10 μmol/L备用。

1. 3 样品DNA提取

样品DNA提取按照天根生化科技（北京）有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒说明进行操作，测定样品DNA浓度并判断质量。

1. 4 四重PCR的建立

1. 4. 1 单基因特异性 反应体系25.00 μL，包括2×Master Mix 12.50 μL，上、下游引物各1.00 μL，样品DNA模板2.00 μL，加ddH2O至25.00 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，进行35个循环；72 ℃ 延伸3 min，4 ℃保存。反应产物采用Qiagen毛细管电泳仪对结果进行分析。

1. 4. 2 四重PCR条件优化 利用以下体系和程序对四重PCR退火温度进行优化。反应体系25.00 μL，包括2×Master Mix 12.50 μL，4组上、下游引物各0.25 μL，样品DNA模板2.00 μL，加ddH2O至25.00 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，退火温度设置6个梯度，分别为50、54、56、58、60和64 ℃，时间均为30 s，72 ℃ 30 s，进行35个循环；72 ℃延伸3 min。反应产物采用Qiagen毛细管电泳仪对结果进行分析，选择适合的退火温度。

利用以下体系和程序对四重PCR引物浓度进行优化。反应体系25.00 μL，包括东洋纺2×Master Mix 12.50 μL，4对引物终浓度按照表2设置引物浓度梯度，模板DNA 2.00 μL，加ddH2O至25.00 μL。扩增程序选择退火温度优化后确定的程序。反应产物采用Qiagen毛细管电泳仪对结果进行分析，选择适合的引物浓度配比。

1. 5 四重PCR方法灵敏度检测

将基因组DNA进行梯度稀释，使每个反应体系中转基因油菜T45基因组DNA的浓度分别为0.02、0.01、0.005、0.003、0.001和0.0005 ng/μL，利用四重PCR试验优化后的檢测体系进行方法灵敏度检测试验。

1. 6 已知样品验证

利用四重PCR试验优化后的检测体系，对已知样品进行验证。

2 结果与分析

2. 1 样品DNA提取

样品总DNA浓度和质量通过NanoDrop 1000（Thermo scientific）超微量分光光度计测定，所有样品OD260/OD280范围在1.8～2.0，OD260/OD230大于2.0，浓度均大于25 ng/μL，说明样品DNA的质量和浓度能满足PCR扩增要求。最后将样品DNA的浓度稀释至25 ng/μL备用。

2. 2 四重PCR单基因特异性验证

单基因特异性验证结果（图1）表明，引物序列分别对4个目的基因片段的扩增具有特异性，无非特异性条带出现。选择的引物可用于4个目的基因片段的多重PCR检测体系研究。

2. 3 四重PCR条件的优化

退火温度梯度试验结果（图2）表明，选择的50～60 ℃温度梯度均可扩增到目的条带，在64 ℃条件下，T-CaMV 35S基因片段未能扩增出条带。其中，在50 ℃条件下出现了多条非特异性条带；在60 ℃条件下，T-CaMV 35S基因的目的片段扩增效率明显低于其他3个基因片段，基因片段间扩增效率不一致。在其他3个退火温度条件下均可扩增到目的基因条带，尽管均出现一条540 bp大小的非特异条带，但并不影响对其他目的基因片段的识别，在考虑所有目的基因片段扩增效率和单基因扩增时的退火温度等情况下，最终确定四重PCR反应的退火温度为58 ℃。

引物浓度梯度试验结果（图3）表明，各引物终浓度按照方案④配比时，各目的基因片段的扩增效率相对一致；而其他几种引物浓度配比方案结果均不理想，目的基因片段存在无扩增、扩增效率不一致等现象。最终确定最优化的引物终浓度（μmol/L）配比CruA∶P-CaMV 35S∶T-CaMV 35S∶pat为0.1∶0.2∶0.2∶0.2。

2. 4 四重PCR灵敏度

通过四重PCR灵敏度试验，结果（图4）显示，在模板总量不低于0.01 ng/μL时，均可有效扩增出4个目标片段。当模板总量低至0.005 ng/μL时，虽然几个基因片段均能得到扩增，但外源基因P-CaMV 35S、T-CaMV 35S和pat片段扩增量太小，条带模糊。因此，确定四重PCR检测体系的灵敏度为0.01 ng/μL。

2. 5 已知样品验证

采用建立的四重PCR对已知样品进行检测，结果（图5）表明，T45检出CruA（151 bp）、P-CaMV 35S（195 bp）、T-CaMV 35S（134 bp）和pat（262 bp）基因片段，GTS40-3-2检出P-CaMV 35S（195 bp）基因片段，Bt11检出P-CaMV 35S（195 bp）和pat（262 bp）基因片段， GT73检出CruA（151 bp）基因片段，MS8检出CruA（151 bp）基因片段，TT51-1无任何基因片段，所有样品扩增的目的条带与预期的基因元件分子特征一致。此结果进一步验证了建立的四重PCR检测方法具有可靠性。

3 讨论

转基因产品检测技术主要有蛋白质和核酸检测两类，核酸检测技术中运用较多的是普通PCR，其具有敏感、快速、简便的特点，主要用于检测转基因作物及产品中的单个外源基因（张富丽等，2009；尹全等，2010）。在产品检测时，通常需要检测多个外源基因以确认其所含转基因成分及是否为转基因产品，采用普通PCR分别对这些外源基因进行检测时存在时间和试剂耗费大、操作繁琐等缺点（郑景生和吕蓓，2003）；多重PCR只需一个反应和一次电泳即可同时检出多个目的基因片段，可极大地节约试剂并节省时间（邵碧英和陈文炳，2005）。在毛细管电泳结合多重PCR检测分析研究方面，周颖等（2007）采用无胶筛分毛细管电泳—激光诱导对三重PCR反应扩增产物进行荧光检测，建立了多重PCR-毛细管电泳—激光诱导荧光快速检测转基因玉米的新方法；张春娇等（2011）采用毛细管电泳—紫外检测方法分析了转基因玉米Ly038、Mon863和Mon810的品系特异性基因多重PCR产物，建立了转基因玉米品系特异毛细管电泳—紫外检测方法。本研究利用毛细管琼脂糖预制胶电泳技术对多重PCR产物进行分析，建立了四重PCR毛细管电泳检测抗除草剂转基因油菜T45方法，节约了模板和试剂，并缩短了检测时间，具有高效、快速、灵敏且经济环保的优点。

在建立体系的过程中，考虑到不同引物序列对PCR结果存在较多影响，本研究优先选择现有国家或行业标准中的引物，这些引物均经过反复试验及多方验证，至少单基因PCR可得到保障，有利于多重PCR试验的进一步开展。引物浓度配比及退火温度依据目的条带特异、引物二聚体少，各基因片段扩增效率相对一致的要求（Henegariu et al.，1997），最终确定了四重PCR检测体系的适宜引物浓度配比和退火温度。利用建立的四重PCR检测体系进行灵敏度试验，最终确定本体系的检测灵敏度为0.01 ng/μL，略高于Yang等（2006）建立的转化体检测方法和农业部科技发展中心牵头制定的国家标准，其原因可能是多对引物在反应体系中对模板产生竞争而导致检测灵敏度有所下降。

本研究在综合考虑扩增效率和简化试验优化步骤等前提下，选择Master Mix PCR试剂，而未选择DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+单独包装的PCR试剂。但从检测方法实用性考虑，下一步可利用DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+单独包装的PCR试剂对检测体系进行优化。

4 结论

本研究建立的抗除草剂转基因油菜T45品系四重PCR检测方法可实现在一个反应体系中同时检测抗除草剂转基因油菜T45内源参照基因和多个外源基因成分，有效简化了操作步骤，缩短了检测时间并提高了检测效率，为转基因油菜T45提供了一种有效的检测手段。

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（責任编辑 王 晖）