巴西橡胶树HbMlo8基因的功能研究

张宇 何海霞 王萌 潘敏 李晓娜 郑服丛

摘 要 Mlo基因是植物体内具有负向调控功能的一类基因。为揭示HbMlo8基因在橡胶树中的功能，分析了该基因在巴西橡胶树不同组织中的表达情况，在机械损伤、干旱、白粉菌侵染、ABA、ETH、JA和H2O2处理下的表达模式。结果表明：HbMlo8基因在橡胶树的树皮、胶乳、花和叶中均有表达，主要在树皮和花中表达。机械损伤、干旱、白粉菌侵染均会使HbMlo8在橡胶树叶片中的表达量显著上调。橡胶树叶片中HbMlo8基因在ETH处理早期下调表达，处理10 h后开始显著上调。在ABA、H2O2和JA处理下，HbMlo8基因均呈现下调表达现象。说明HbMlo8可能参与橡胶树对白粉菌和非生物胁迫的响应过程以及激素信号转导路径，为阐明HbMlo8基因在橡胶树生长和逆境响应机制中的功能研究打下良好基础。

关键词 巴西橡胶树；HbMlo8；表达分析；激素；逆境

中图分类号 S432.1；S794.1 文献标识码 A

Abstract Mlo gene is a kind of gene with the function of negative regulation in plants. In order to reveal the function of HbMlo8 gene in rubber tree， this study analyzed the expression level of HbMlo8 in different tissues of rubber tree， and the expression profiles of HbMlo8 under the treatment of the leaves with wounding， drought， powdery mildew infection， ABA， ETH， JA and H2O2， respectively. The results showed that HbMlo8 gene expressed in bark， latex， flower and leaf， mainly in bark and flower. Wounding， drought and powdery mildew infection treatment positively induced the expression level of HbMlo8 significantly. The gene downregulated at early stages under ETH treatment， then began uncommonly upregulated at ten hours of treatment. ABA， H2O2 and JA could negatively induce HbMlo8 significantly. The study suggested that HbMlo8 had nothing to do with the resistance to powdery mildew， but involved in response mechanisms of stress resistance and signal transduction pathway of plant hormones. The study lays a good foundation for research the function of HbMlo8 in the growth and response mechanisms of stress in rubber tree.

Key words Hevea brasiliensis； HbMlo8； Expression analysis； Hormone； Stress environment

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.08.011

Mlo（Mildew resistance locus o）基因是植物中特有的一类基因家族[1]，最早是在大麦中发现[2]。大麦HvMlo编码的蛋白主要定位在细胞质膜上，具有典型的拓扑结构，含有7个跨膜螺旋区、一个核定位信号（K-K-K-V-R）和两个酪蛋白激酶Ⅱ位点（S/T-X-X-D/E）[2]。目前，该基因在植物中得到了普遍的研究。现已鉴定出的Mlo基因有137个左右，存在于绝大多数的被子植物中[3-10]。对其功能的研究主要集中在大麦、拟南芥等植物中，研究表明HvMlo基因是大麦抗白粉菌的负向调控因子，具有负向调控植物防卫机制的功能[11-12]。拟南芥中的AtMlo2、AtMlo4、AtMlo6、AtMlo7、AtMlo11、AtMlo12[13]、水稻中的OsMlo2[14]和小麦中的TaMlo1、TaMlo2、TaMlo3[15]等不仅具有类似HvMlo基因的感病功能，同时也参与了不同生物和非生物胁迫的调控作用，以及对植物生长发育的影响。

巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）作为世界上大规模种植的产胶树种，其植株生长和胶乳产量受白粉病害的严重制约[16]。干旱可导致巴西橡胶树病虫害发生率、死皮率增加，还增加灾害预报和管理成本[17-18]，降低胶乳产量[19]，严重时会导致植株死亡[20]。因此，研究具有负向调控植物防卫功能的Mlo基因在橡胶树中的作用，有助于在分子水平上解决橡胶树的生长和胶乳产量受影响的问题。笔者在巴西橡胶树中已克隆出1个HbMlo基因，其ORF序列由1668个碱基组成，编码555个氨基酸序列。HbMlo基因推导的蛋白具有1个Mlo保守结构域，含有8次跨膜结构，被命名为HbMlo8[21]。根据结构分析推测其参与橡胶树抗逆反应。本研究使用荧光定量PCR技术，分析橡胶树叶片中HbMlo8基因在干旱、机械损伤、白粉菌和植物激素[脱落酸（ABA）、乙烯利（ETH）、茉莉酸（JA）和过氧化氢（H2O2）]处理下的表达情况，以及在橡胶树不同组织中该基因的表达水平，为探究HbMlo8基因在橡胶树中的功能打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

HbMlo8基因为笔者克隆基因[21]，以甘油菌保存于-80 ℃。

基因组织表达分析使用海南大学环境与植物保护学院教学基地的巴西橡胶树无性系CATAS7-33-97 15年生的成龄开割树为材料。白粉菌侵染实验使用保存的白粉菌生理小种HO-73，在生长到两蓬叶的巴西橡胶树GT1实生苗上进行。在CATAS7-33-97芽接苗上进行干旱、机械损伤、脱落酸（ABA）、乙烯利（ETH）、茉莉酸（JA）和过氧化氢（H2O2）处理。

1.2 方法

1.2.1 样品的采集和cDNA的合成 采集15年生的成龄开割橡胶树上的胶乳、花、叶和树皮，-80 ℃保存待用。白粉菌处理采用Wang等[22]的方法，在生长到两蓬叶的巴西橡胶树GT1实生苗叶片上接种白粉菌，采集接种后白粉菌盛发期和后期的叶片。干旱处理将橡胶树芽接苗置于培养箱中，模拟室外环境，采用断水处理，连续采集处理前1 d和断水后10 d深绿期的叶片[23]；机械伤害处理采用Piffanellip等[24]的方法，使用解剖刀在芽接苗的叶片上割出横切面，再将离体叶片置于水中，收集处理后0.5、1、2、6、12 h的叶片。在芽接苗上分别喷施200 μmol/L ABA、1.0%（V/V）ETH、200 mmol/L JA和2%（V/V）H2O2，在处理后0、0.5、2、6、10、24、48、72 h采集样品。将不同处理下不同时间段采集到的叶片置于-80 ℃冷冻保存。

采用何鑫等[25]方法提取橡胶树胶乳、叶片、树皮和花的总RNA。用超微量核酸蛋白分析仪检测所提RNA的浓度、纯度，并用1%甲醛变性胶电泳检测RNA的完整性[26]。再用RNA反转录试剂盒进行反转录，得到各样品的cDNA。

1.2.2 巴西橡胶树HbMlo8基因表达分析 采用primer5.0软件设计HbMlo8基因荧光定量表达分析的引物HbMlo8F（5′-GTTATGGCTGCAAGTAGTGAC-3′）和HbMlo8R（5′-GAAGACCCTTTTCCAAGAGA-3′）。使用橡胶树HbACTIN（F： GATGTGGATATCAGGAAGGA和R： CATACTGCTTGGAGCAAGA）、Hb18s RNA（F： GCTCGAAGACGATCAGATACC和R： TTCAGCCTTGCGACCATAC）和HbUBC4基因（F： TCCTTATGAGGGCGGAGTC和R： CAAGAACCGCACTTGAGGAG）为内参基因，使用NormFinder软件分析3个内参基因在各种处理下的稳定性[27]，最终选定HbACTIN作为本研究的内参基因，进行荧光定量PCR反应[28]，基因的表达水平通过2-ΔΔT法进行计算[29]，分析HbMlo8基因在不同处理条件下的表达情况。

1.3 数据统计分析和作图

所有处理采用3次生物学重复和3次技术重复，采用SAS 9.1.3进行数据统计分析，采用单因素方差分析和Duncan检验分析。作图使用Origin2015科技绘图软件。

2 结果与分析

对成龄橡胶树的树皮、胶乳、花和叶进行HbMlo8基因的表达分析，结果表明（图1），该基因在测定的4个组织中均有所表达，其中树皮中的表达水平最高，在花中的表达量次之，胶乳和树叶中表达量相对较低。说明HbMlo8基因主要在树皮和花中表达。

白粉菌侵染橡胶树实生苗的叶片后，叶片中HbMlo8基因的表达情况如图2所示：随着白粉菌侵染的加重，HbMlo8基因的表达水平差异性显著，呈现先上升后下降的规律。在5级病害时，基因的表达量达到处理前的1.6倍。7级病害时，HbMlo8表达水平显著下降，但仍高于处理前水平。说明在1～5级白粉病病害范围内，白粉菌侵染会诱导HbMlo8表达量的显著增加。

机械伤害处理橡胶树叶片后的表达情况见图3，可见，机械伤害能够诱导HbMlo8基因在橡胶树叶片中的表达。在机械伤害处理叶片1 h后，HbMlo8基因在叶片中显著性上调表达，表达量达到最高峰，随后又显著下调。说明HbMlo8在橡胶树机械伤害的早期就起到调节作用。

干旱处理橡胶树芽接苗10 d，采集叶片进行基因表达分析结果见图4，可见，在干旱胁迫处理下，叶片中HbMlo8基因的表达量随着干旱处理天数的增加而增加，到干旱胁迫处理9 d时，基因的表达量显著上调，达到最高值，是处理0 d的6.5倍。说明橡胶树HbMlo8基因的表达水平受干旱胁迫影响。

ABA、ETH、JA 3种激素和H2O2处理橡胶树叶片后，HbMlo8基因表达情况如图5所示，ABA处理叶片后，HbMlo8基因显著下调表达，基因表达量随着处理时间的增加不断下降。用ETH处理过的叶片，在处理后的2 h内，叶片中HbMlo8基因的表达量逐渐上升。在处理后6 h，该基因显著下调表达，处理10 h表达量达到最小值。随后表达量开始显著上升，至处理后72 h时，HbMlo8基因表达量达到表达最高值。用JA处理后，在处理0.5 h叶片中的HbMlo8基因表达量显著上升，但随着处理时间的延长，基因表达量呈现持续下降的趋势。H2O2作用下的叶片中，HbMlo8基因的表达量在处理2 h显著上升，达到表达水平最高峰，随后随着处理时间的延长基因表达量持续下降。

3 讨论

Mlo基因是一类具有保守性的多基因家族。本研究中，橡胶树HbMlo8在树皮、胶乳、花和叶中均有表达，但主要在树皮和花中表达。拟南芥AtMlo7和AtMlo8在绝大多数组织中都有所表达[30]，甜瓜CmMlo1、CmMlo2、CmMlo3基因同样在测定的组织中均有表达。其中，CmMlo1主要在子叶和花中表达，CmMlo2主要在真叶中表达，CmMlo3则主要在幼果、根和花中表达[31-32]。野蔷薇RmMlo在野蔷薇的根中不表达[33]。说明Mlo基因在大多数植物的不同组织中均有所表达，在同一植物中，不同的Mlo基因表达的主要部位不同。在白粉菌诱导下，从侵染初期到5级病害时，橡胶树叶片中HbMlo8基因的表达量持续显著上升，随后显著下降。在葡萄VvMlo7、VvMlo13[34]、甜瓜叶片中CmMLO2[31]、月季RhMLO1和RhMLO2基因[35]等大多数植物中，随着白粉菌侵染的加重，Mlo基因表达差异性显著，呈现先上升后下降的规律。符合大麦HvMlo正向调控感白粉病作用机制[36]。

本研究中，在机械伤害处理下，橡胶树叶片中HbMlo8基因的表达水平在处理后1 h显著升高，达到最大值。橡胶树HbMlo8随着干旱处理时间的延长，表达量显著上升。说明叶片中HbMlo8基因受机械伤害和干旱诱导。目前，已在辣椒CaMlo2基因的研究中发现，该基因参与干旱反应[37]。推测HbMlo8基因可能正向调控橡胶树对干旱和机械伤害的胁迫作用，具体作用机制有待进一步实验研究。橡胶树作为热带经济作物，干旱会使橡胶树病虫害加重、死皮率增加[17-18]，影响胶乳产量[19]。HbMlo8基因在此胁迫下的研究对提高橡胶树胶乳产量具有重要意义。Mlo基因不仅与植物的抗白粉病过程[38]、植物的逆境胁迫响应[24]有关，还与植物的生长发育有关[13]。本研究中，在JA处理橡胶树芽接苗0.5 h后，基因表达量显著下调。ETH会诱导HbMlo8基因表达水平在处理初期显著上升，随后显著下调再显著上调。说明JA和ETH在处理的早期便诱导HbMlo8基因表达量发生变化。HbMlo8基因在ABA处理的全过程中其表达量均处于下降趋势。HbMlo8基因在H2O2诱导下，其表达水平在处理后2 h显著上升，紧接着显著下降。表明HbMlo8基因的表达水平受ABA和H2O2调节。在辣椒CaMlo2基因的研究中，采用基因沉默发现CaMlo2基因是ABA信号的负调控因子[38]，由此推测HbMlo8基因也参与橡胶树体内JA、ETH、ABA和H2O2的信号传导过程。有研究发现JA能够诱导橡胶树的乳管分化，促进橡胶生物合成[35，39]，调节植物生长发育[40]，ETH能够刺激胶乳的产生[38]。ABA在植物干旱和病虫害等逆境胁迫中起到重要作用[41]，H2O2在应对逆境产生的抗病防御反应和调控植物的生长发育等诸多生理过程中发挥着重要的作用[42]。本研究为进一步探究HbMlo8基因在橡胶树逆境中的作用机制以及胶乳的高量生产打下良好基础。

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