七叶树内生真菌的分离及活性研究

杨方玉, 张波, 涂敏, 丁小维, 邓百万, 陈文强, 刘开辉

(1.陕西理工学院 生物科学与工程学院， 陕西 汉中 723000；2.汉中市第八中学， 陕西 汉中 723000)



七叶树内生真菌的分离及活性研究

杨方玉1, 张波1, 涂敏2, 丁小维1, 邓百万1, 陈文强1, 刘开辉1

(1.陕西理工学院 生物科学与工程学院， 陕西 汉中 723000；2.汉中市第八中学， 陕西 汉中 723000)

[摘要]利用组织培养法，从秦岭紫柏山七叶树茎段中分离得到45株内生真菌，通过真菌形态特征和ITS序列分析，将其鉴定到7个属如链格孢属(Alternaria)、鬼伞属(Coprinellus)、枝孢属(Cladosporium)及颈点霉属(Phoma)等。采用紫外-可见分光光度法、高效液相(HPLC)及质谱(MS)方法检测表明，菌株SL-6的代谢产物中存在七叶皂苷类化合物。抑菌活性试验显示，菌株SL-6的发酵液对胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)及棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)植物病原菌表现出较强的抑制活性。

[关键词]七叶树；内生真菌；生物活性

内生真菌是指在其生活史的全部或某一阶段生活在健康植物组织中，而对植物组织没有引起明显的外部特征或病害症状的微生物[1]。自从1993年Stierle等[2]报道从短叶红豆杉的韧皮部分离到的一株内生真菌——安德氏紫杉霉(Taxomycesandreanae)，可产生与宿主相同的抗肿瘤代谢产物紫杉醇以来，植物内生真菌的研究已经成为微生物领域研究的热点之一。目前，特别是从药用植物中获得了大量的内生真菌，一些内生真菌代谢产生具有生物活性的天然产物例如喜树碱[3-4]、紫杉醇及长春新碱等[5]。以前的文献报道表明，内生真菌能产生与宿主相同或相似的具有生理活性的次生代谢产物，并表现出抗炎[6]、抗癌[7]、免疫抑制[8]及抗虫生物功能[9]。因此，内生真菌被认为是产生具有生物活性次生代谢产物的重要来源之一[10]。

尽管植物内生真菌广泛存在于自然界，但不同种属真菌的分布具有宿主植物及其组织的特异性，至今许多药用植物内生真菌还未被分离[11-12]。因此，研究药用植物内生真菌有助于发现新的内生真菌菌种和新的活性化合物。七叶树(A.chinensis)又叫梭椤树，为无患子目(Sapindales)，七叶树科(Hippocastanaceae)，七叶树属(AesculusLinn.)的落叶乔木，其干燥成熟种子“娑罗子”为常见中药材，主要活性成分为七叶皂苷A、B、C、D共4类组份，根据德国DAC定义，七叶皂甙A、B又称β-七叶皂苷，七叶皂甙C、D又称α-七叶皂苷，α-七叶皂苷和β-七叶皂苷是七叶皂苷的异构体。七叶皂苷类化合物有显著的消炎、抗渗出、化瘀血的作用，能提高毛细血管张力，具有控制水肿、改善血液循环和调节胃肠道的功能[13-15]，因此被广泛应用于临床治疗中。然而，目前关于七叶皂苷的研究主要集中在化学分离提取及临床应用方面，有关七叶树内生真菌的研究报道较少。本研究分离了秦岭七叶树内生真菌，挖掘出产七叶皂甙化合物的真菌及抗菌活性菌株，将为七叶树内生真菌的利用提供重要的种质资源。

1试验材料与方法

1.1试验器材

1.1.1试验材料

用于内生真菌分离的植物茎段采自秦岭紫柏山森林地带(33°40′55″N，106°49′45″E)的多年生七叶树(A.chinensis)。

1.1.2主要药品和仪器

七叶皂苷对照品(含七叶皂苷A、B、C、D组份)购自中国药品生物制品检定所(纯度≥98%)，分析检测所用的甲醇和乙腈为色谱纯，其它未注明的药品均为分析纯。

主要仪器设备：PCR扩增仪(Bio-Rad)、凝胶成像系统(Bio-Rad)、DNA测序仪(ABI PRISM 377)、高速冷冻离心机(Eppendorf)、高效液相色谱仪(Agilent)及紫外分光光度仪(Beckman DU-40)等。

1.2试验方法

1.2.1内生真菌的分离

将植物材料置于自来水下冲洗4～5 h，在无菌条件下依次用体积分数0.1%的氯化汞浸泡10 min和体积分数70%的酒精浸泡30 s，之后迅速用无菌水冲洗6次。将表面消毒彻底的七叶树韧皮组织切割成0.5 cm2的小块，并置于改良马铃薯培养基(去皮马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨0.5 g/L，KH2PO45 g/L，MgSO4·7H2O 3 g/L，维生素B1 0.1 g/L，琼脂粉 12 g/L，pH自然)上，于28 °C恒温培养2～15 d，挑取菌丝尖端，分离纯化内生真菌。

1.2.2内生真菌的鉴定

用CTAB法[16]提取真菌基因组DNA，用真菌通用引物ITS1(5’-TTCGTAGGTGAACCT GCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)扩增ITS基因片段，PCR反应条件按文献[17]进行。PCR产物经琼脂糖检测和切胶回收后直接用于序列的测定。将所得序列提交GenBank数据库中进行BLAST检索，下载同源性较高的数据，生成Fasta格式文件。用Clusta-X软件[18]对序列进行比对及人工校正，利用Mega 3.1软件[19]构建N-J系统发育树[20]。

1.2.3液态发酵、代谢产物的提取及分析检测

内生真菌分别接种到改良马铃薯液体培养基中，于28 °C摇床(160 r/min)发酵培养7 d。过滤收集菌丝体经反复冻融后，被充分研磨。在超声波下用充分乙酸乙酯浸提菌丝体和发酵液，合并萃取液并在减压旋转蒸发器中浓缩，用甲醇溶解并定容于25 mL容量瓶中，用于后续检测。HPLC检测条件：色谱柱C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，紫外检测波长220 nm，流动相为甲醇-乙腈-水(体积比为53∶36∶11)，进样量20 μL，流动相流速为1 mL/min及柱温25 ℃。质谱检测条件：流动相为甲醇-乙腈-水(体积比为53∶36∶11)，碰撞电压2 200 V，毛细管流量2 μL/min。

1.2.4抗菌活性分析

分别采用滤纸片扩散法检测内生真菌发酵液(各取50 μL)对指示菌-枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaure)、胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、水稻纹枯病菌(Thanatephoruscucumeris)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)和棉花黄萎病菌(Verticilliumdahliae)的抗菌作用。

2结果与分析

2.1内生真菌的鉴定

从七叶树中分离得到45株内生真菌，初步根据菌落及显微形态特征，分离菌株初步被归类为Alternariaspp.，Phomaspp.和Aspergillusspp.等类群。代表菌株ITS的序列长为600～650个碱基，其系统发育分析如图1所示，以Saccharomycescerevisiae(Z95941)为外群，菌株SL-6、SL-9及SL-10同GenBank数据库中Phomamacrostoma(KF293781)、P.glomerata(FJ517547)及P.medicaginis(KF293990)等的序列同源性达100%，在进化树中很好地类聚到Phoma分枝上，步长值为100，因此，SL-6、SL-9和SL-10属于Phoma的不同种；SL-1同数据库中Alternariaalternate(KP324980)、A.alternate(KP861901)及A.alternate(KP861900)等的序列同源性高达100%，并在NJ树中聚于Alternaria分枝上，步长值为100，该菌被鉴定为Alternaria属真菌；SL-3和SL-7同Helminthosporiumsp.(KJ877647)、H.velutinum(JF502424)及H.velutinum(JN198435)同源性仅为93%，该菌株可能是格孢腔菌目(Pleosporales)未报到的新成员；SL-5、SL-4和SL-2分别与Acremoniumbrachypenium(NR_077119)、UnculturedAcremoniumcloneF2-K28(KC535108)、Cladosporiumsphaerospermum(KJ728690)、C.Sphaerospermum(KC113297)、C.sphaerospermum(399762972)、Coprinellusradians(HQ380760)及C.domesticus(KP132301)序列同源性在97%～100%之间，分别聚于Acremonium、Cladosporium和Coprinellus分枝上，步长值为100。因此，菌株SL-5、SL-4和SL-2分别被鉴定为Acremonium、Cladosporium和Coprinellus属真菌。

图1　基于ITS邻接系统发育树分析七叶树内生真菌多样性

2.2真菌七叶皂苷的检测

紫外-可见分光光度法光谱扫描结果如图2所示，在220 nm处，七叶皂苷对照品和菌株SL-6发酵产物的光谱图相似，可以初步判断该菌发酵液中可能含七叶皂苷或结构类似物。

(a) 标准品　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(b) 样品图2　紫外吸收检测七叶皂苷

HPLC检测结果如图3(a)所示，七叶皂苷对照品中包括七叶皂苷A、B、C及D组份，上述组份的出峰时间分别为6.969、8.253、9.492、10.831 min，而在菌株SL-6的发酵提取物中检测到对应组份的保留时间分别为7.111、8.228、9.136 min(图3(b))，表明内生真菌Phomasp.SL-6谢产物中可能存在七叶皂苷A、B及C或相关其衍生物。

(a) 标准品　　　　　　　　　　　　　　　　　(b) 样品图3　高效液相色谱检测七叶皂苷

对七叶皂苷对照品和菌株SL-6菌株提取物进行质谱分析结果表明，七叶皂苷标准品产生一个MH+核质比为1 153.5的离子峰(图4(a))，菌株Phomasp.SL-6的MH+核质比为1 153.6的离子峰(图4(b))，标准品和样品的质谱图基本一致，进一步表明内生菌SL-6代谢产生七叶皂苷类化合物。

(a) 标准品　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(b) 样品图4　质谱检测七叶皂苷

2.3抗菌活性研究

为了挖掘七叶树的抗菌活性菌株，本研究利用滤纸片扩散法研究内生真菌的抗菌活性(如表1)。菌株Alternariasp.SL-1的发酵液对B.subtilis和S.aureus两种革兰氏阳性菌有微弱的抑制作用，抑菌圈的大小为6～10 mm。此外，Phomasp.SL-10菌株的发酵液对T.cucumeris有很微弱的抑制作用。菌株Phomasp.SL-6发酵液对植物病源真菌C.gloeosporioides，S.sclerotiorum和V.dahliae具有较强的抑制作用，抑菌圈为16～26 mm。其余菌株SL-2、SL-3、SL-4、SL-5、SL-7和SL-9的发酵液未观察到明显的抑菌活性。上述研究表明，菌株Phomasp.SL-6在重要植物病源菌的生物防治中可能有潜在的应用价值。

表1　内生真菌发酵液对致病性微生物的抗菌活性

注：Bs=Bacillussubtilis，Ec=Escherichiacoli，Sa=Staphylococcusaureus，Cg=Colletotrichumgloeosporioides，Tc=Thanatephoruscucumeris，Ss=Sclerotiniasclerotiorum，Vd=Verticilliumdahlia；抑菌圈直径(φ，mm)，“-”表示没有抑菌效果，“+”表示6 mm<φ<10 mm，“++”表示10 mm<φ<16 mm，“+++”表示16 mm<φ<26 mm。

3讨论

七叶树是重要的药用植物，目前有关七叶树的研究主要集中在种子化学成分分析、药理作用[21]以及七叶皂苷的纯化[22]等方面，而关于七叶树内生真菌分离鉴定的研究鲜有报道。本研究从秦巴山区野生七叶树内共分离得到45株内生真菌，它们被鉴定为7个属。菌株Phomasp.SL-6发酵液中存在七叶皂苷，之前有关Phoma属也从其他药用植物中分离报到过，例如Camelliajaponica[23]和A.ginnalaMaxim[24]，并且都能够产生大量的活性物质，如赤霉素、甲基二苯醚[25]以及新型抗肿瘤和抗菌活性代谢产物。本课题组之前从秦岭中国红豆杉、喜树内中分离到能产紫杉醇和喜树碱的真菌，部分菌株具有工业发酵生产上述药物的应用潜力。菌株Phomasp.SL-6能够产生七叶皂苷，表明秦岭地区药用植物内生菌在植物药物开发方面有巨大的潜力，需要进一步挖掘。

近年来，内生真菌已成为研究人员发现天然抗菌活性物质的重要来源。江曙等[26]研究发现药用植物内生真菌具有广泛的抗菌性。黄东益等[27]在旗草(Brachiariabrizantha)内生真菌与旗草抗病性研究中发现，对病原菌生长抑制能力强的内生真菌培养物在旗草体内也表现出较强的抗病性。本研究报道的秦岭地区七叶树内生真菌Phomasp.SL-6发酵液能够很好地抑制3种植物病原菌C.Gloeosporioides、S.sclerotiorum和V.dahlia，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌无明显的抑制作用，这同此前王绪英[28]发现植物七叶皂苷对金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用不一致，可能是由于真菌发酵液中七叶皂甙含量较低的缘故。下一步的研究工作将集中在分离和解析Phomasp.SL-6发酵液中的抗菌活性物质，这对于研发绿色生物农药具有潜在的科学意义。

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[责任编辑：魏 强]

Isolation and characterization of endophytic fungi fromAesculuschinensis

YANG Fang-yu1,ZHANG Bo1,TU Min2,DING Xiao-wei1,DENG Bai-wan1,CHEN Wen-qiang1,LIU Kai-hui1

(1.School of Bioscience and Engineering, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723000, China;2.The Eighth Middle School of Hanzhong City, Hanzhong 723000, China)

Abstract:In this study, a total of forty-five endophytic fungi has been isolated from stems of A.chinensis grown on the Zibai mountain of Qinling. They are classified into 6 genera, such as Alternaria, Coprinellus, Cladosporium, and Phoma, based on morphological characteristics and internal transcribed spacer(ITS) sequence analysis. Of the strains obtained, SL-6 produces escin compounds in culture broths detected by Ultraviolet-visible Spectrophotometry, high performance liquid chromatography combined with mass spectrometry assays(HPLC-MS). Moreover, the extracts of the strain SL-6 exhibit significantly antagonistic activities against plant pathogenic fungi, including C.gloeosporioides, S.sclerotiorum and V.dahliae.

Key words:A.chinensis;endophytic fungi;bioactivity

[中图分类号]Q949.32

[文献标识码]A

作者简介：杨方玉(1989—)，男，河南省延津县人，陕西理工学院硕士研究生，主要研究方向为微生物资源的开发与利用；[通信作者]刘开辉(1979—)，男，陕西省旬阳县人，陕西理工学院副教授，硕士生导师，博士，主要研究方向为微生物资源的开发与利用。

基金项目：陕西省教育厅科学研究计划项目(11JK0616)

收稿日期：2015-06-27修回日期：2015-08-25

[文章编号]1673-2944(2016)02-0064-06