秦巴山区蜜环菌酯酶同工酶的研究

杨海旭，　邓百万，2，　陈文强，2，　虞小燕，　解修超，2

(1.陕西理工学院 生物科学与工程学院， 陕西 汉中 723000；2.陕西省食药用菌工程技术研究中心， 陕西 汉中 723000)



秦巴山区蜜环菌酯酶同工酶的研究

杨海旭1，邓百万1，2，陈文强1，2，虞小燕1，解修超1，2

(1.陕西理工学院 生物科学与工程学院， 陕西 汉中 723000；2.陕西省食药用菌工程技术研究中心， 陕西 汉中 723000)

[摘要]通过垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)对18个蜜环菌菌株同工酶进行了研究。结果表明，18个蜜环菌菌株酯酶同工酶的活性不同，酶谱条带数在1～7条之间。通过相似度指数确定不同蜜环菌种类之间的亲缘关系，其中京234-1和京234-2，M-8、M-12和寿县2号，京234-5和A-12，东北5号和东北4号，云南-1、云南-2、A-13的相似系数为1.000，说明它们之间的亲缘关系非常近；M-15、东北5号、东北4号和京234-1、京234-2、京234-3、京234-4，城固与京234-3、京234-4，云南-1、云南-2、A-13和京234-3、京234-4的相似程度最低，相似系数仅为0。

[关键词]蜜环菌；酯酶同工酶；电泳

蜜环菌(Armillariamellea)别名蜜环蕈、榛蘑、苞谷蕈、青冈蕈。真菌界(Eukaryota)，担子菌门(Basidiomycota)，担子菌纲(Basidiomycetae)，伞菌目(Hymenomycetes)白磨科(Tricholomataceae)蜜环菌属(Armillariella)[1-2]。蜜环菌是兰科天麻属植物天麻的共生菌，它们二者形成菌根，促进天麻的生长[3]，在长期使用过程中易发生退化[4]。同时，由于种植户在菌种管理方面存在缺陷，出现同种菌种被冠以不同的名字、代号，不同菌株又命以同种名字，导致菌种混乱，使得蜜环菌在实际栽培及天麻生产中产生诸多问题。

同工酶是生物体内催化相同反应而分子结构不同的酶，其蛋白质分子结构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异[5]。同工酶技术广泛应用在真菌分类学中，包括菌种鉴定和菌种关系的研究、诱变育种、杂交育种、种质资源遗传图以及连锁群识别等[6]。尤其是在鉴定食用菌上优于传统形态学方法，其操作简便，准确度高[7]。近年来，大量学者对真菌的酯酶同工酶进行研究，如李守勉等[8]对杏鲍菇、郑素月等[9]对平菇、胡先运[10]对花脸香蘑、韦仕岩[11]对金福菇、彭浩等[12]对黑木耳等，充分说明了该技术的广泛应用。酯酶同工酶的研究发现，真菌同工酶分析容易受到取样部位、培养条件、传代次数等的影响[13]，导致结论不同甚至完全相反。本研究选取秦巴山区18个蜜环菌菌株，在培养条件、传代次数相同的情况下对18个蜜环菌菌株酯酶同工酶进行研究，以便于管理并建立秦巴山区蜜环菌种质资源库，并为资源保护利用提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试菌株

京234-1，京234-2，京234-3，京234-4，京234-5，M-8，M-12，M-15，A-9，A-12，寿县2号，城固，东北5号，东北4号，中原，云南-1，云南-2，A-13，依次编号为ZY-1、ZY-2、ZY-3、ZY-4、ZY-5、ZY-6、ZY-7、ZY-8、ZY-9、ZY-10、ZY-11、ZY-12、ZY-13、ZY-14、ZY-15、ZY-16、ZY-17、ZY-18。其中ZY-1、ZY-2、ZY-3、ZY-4、ZY-6、ZY-8、ZY-10、ZY-11、ZY-12、ZY-13、ZY-14、ZY-17、ZY-18由陕西省食药用菌工程技术研究中心提供，ZY-5、ZY-7、ZY-9、ZY-15、ZY-16为自主分离。1.1.2主要仪器

超净工作台(SW-CJ-IF，苏州安泰空气技术有限公司)，生化培养箱(5PX-250B5H-Ⅱ，上海新苗医疗器械制造有限公司)，立式压力蒸汽灭菌锅(LDZX-50KBS，上海申安医疗器械厂)，恒温培养振荡器(ZHWY-B2112B，上海志城分析仪器制造有限公司)，超低温冷冻冰箱(MDF-U32V，日本三洋电器集团)，电子天平(BSA8201，北京赛多利科学仪器有限公司)，电泳仪(DYY-Ⅲ，北京百晶生物技术有限公司)，生物显微电脑图像分析系统(GEL-RAD)。

1.1.3主要药品和试剂

葡萄糖，琼脂，蛋白胨，玉米粉，75%酒精，KH2PO4，K2HPO4，MgSO4，VB1，丙酮，超纯水，坚牢蓝，α-乙酸萘酯，β-乙酸萘酯，蔗糖，溴酚蓝，过硫酸铵，TEMED，Tris，盐酸，甘氨酸，丙烯酰胺，甲叉丙烯酰胺。

1.1.4培养基

固体培养基(CPDA)：马铃薯(去皮)200.0 g，玉米粉50.0 g，葡萄糖20.0 g，琼脂12.0 g，KH2PO45.0 g，MgSO43.0 g，蛋白胨5.0 g，VB1 10.0 mg，pH自然，加水定容至1 000 mL；液体培养基：CPDA培养基不加琼脂。

1.2方法

1.2.1菌索培养

取固体培养基上活化的蜜环菌菌索加入到液体培养基中，24 ℃静置培养18 d。过滤静置培养的菌索，用蒸馏水冲洗2～3次，用无菌滤纸吸干水分，称取5.0 g菌索加2.0 g石英砂和5.0 mL、pH 6.8的Tris-Hcl缓冲液，冰浴下研磨，分装至2.5 mL离心管中，4 ℃下8 000 r/min冷冻离心15 min，吸取上清液，重复一次，置于4 ℃冰箱保存，备用。

1.2.2垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳及染色

电泳体系：电极缓冲液采用Tris-Glycine系统，pH 8.3；凝胶采用10.0%的分离胶和5.0%的浓缩胶。上样量20 μL，溴酚蓝指示剂1滴，上层加10%的蔗糖5 μL，点样完毕后4 ℃下进行电泳。电泳初期电压80 V，样品进入分离胶后稳压在120 V，电泳时间4 h左右。

染色和固定：酶染色液采用坚牢蓝染色系统。称取100 mg坚牢蓝，溶于150 mL 0.1 mol/L pH 6.2的磷酸缓冲液中，过滤后使用；使用再称取50 mg α-乙酸萘酯，50 mg β-乙酸萘酯溶于3 mL丙酮中，然后逐渐倒入上述溶液中，边加边搅使其均匀混合即可。

电泳完毕将凝胶转移至染色液中，在37 ℃下染色，待看到褐色的酯酶同工酶区带时，用水漂洗几次，保存，照相。

1.2.3数据记录和分析

测量相对迁移率(Rf)：Rf=X1/X2，其中X2为固定染色前凝胶中指示剂的迁移距离，X1为固定染色后凝胶中酶蛋白区带的迁移距离，测量Rf时，用直尺测量，应以酶带的中部位置为准。

绘制酯酶同工酶模式图：依据酶谱中酶带的差异以及Rf值绘制酯酶同工酶模式图，由于菌株之间酶带颜色和宽窄的不同，可将酶带分为三级：一级酶带(色深而宽)，二级酶带(色较深而宽)，三级酶带(色较浅而窄)。

相似性系数分析：将凝胶上出现的条带分类，按照条带有无分别赋值，有带记为1，无带记为0，计算酶谱之间的相似性系数(Sc)：Sc=2Nab/(Na+Nb)，式中Nab为Rf值相同的酶带数，Na和Nb为菌株a和菌株b各自的酶带数；当所比菌株的酶带数相同且全部为共有时S=1，当所比物种没有一条共有酶带时S=0。

聚类分析：根据酯酶同工酶电泳结果，在凝胶的某个相同的迁移率位置上有条带的记为1，无条带的记为0，用NTSYS-pc软件算出菌株间的遗传相似系数，并进行聚类分析。

2结果与分析

2.1蜜环菌酯酶同工酶酶谱分析

图1　18株蜜环菌酯酶同工酶电泳谱图

在分离胶浓度为10.0%，浓缩胶浓度为5.0%的电泳条件下对供试的18株蜜环菌酯酶同工酶电泳，得到酯酶同工酶酶谱图(图1)。依据酶谱图中酶带的差异绘制酯酶同工酶模式图(图2)，菌株的编号从左到右依次为ZY-1到ZY-18。

图1结果显示，供试18株蜜环菌酯酶均表现出较强的酯酶活性。18株蜜环菌共检测到70条酯酶同工酶谱带，各个菌株有1～7条不等的酶带，多数为4～6条。其中，ZY-4出现7个酯酶同工酶谱带，ZY-6、ZY-9、ZY-11号出现6个酯酶同工酶谱带，ZY-1、ZY-2、ZY-13、ZY-14、ZY-15出现5个酯酶同工酶谱带，ZY-3、ZY-5、ZY-7、ZY-10有3个同工酶谱带，ZY-16、ZY-17、ZY-18有2个同工酶谱带，ZY-8只有1个同工酶谱带。供试的18个蜜环菌菌株得到了16个酶谱类型，其中ZY-1和ZY-2；ZY-5、ZY-7和ZY-10；ZY-6、ZY-9和ZY-11菌株的带型基本相似。

图2　18种蜜环菌酯酶同工酶模式图

图2结果显示，ZY-6和ZY-11的一级酶带最多有5条；ZY-9有4条一级酶带；ZY-15有3条一级带；ZY-1、ZY-2、ZY-7、ZY-10、ZY-13各有2条一级带；ZY-3、ZY-4、ZY-5、ZY-8、ZY-14、ZY-16、ZY-17、ZY-18各有1条一级带；ZY-12无一级带。

2.218个蜜环菌菌株酯酶同工酶Rf值比较

根据1.2.3的方法测量和计算出18株蜜环菌酯酶同工酶Rf值，见表1。

表1　18株蜜环菌酯酶(EST)同工酶Rf值比较

结果表明，迁移率不同的谱带有16条，其迁移率在0.125～0.850之间，分别为0.125、0.250、0.313、0.375、0.400、0.438、0.463、0.513、0.538、0.575、0.638、0.663、0.700、0.775、0.800、0.850。V酶带是ZY-15所特有，VII酶带是ZY-12所特有，IV酶带和IX是ZY-13、ZY-14特有，XII酶带和XV酶带是ZY-4所特有；I酶带只有ZY-6、ZY-9、ZY-11谱图中出现；VI带只有ZY-4和ZY-15有；ZY-1、ZY-2、ZY-3、ZY-4不具有X酶带；ZY-3、ZY-4、ZY-8、ZY-3、ZY-13、ZY-14不具有XI酶带。这些差异性可作为18个菌株相互区别的鉴定依据。根据同工酶Rf值可以计算出不同酶带分布频率，I-XVI酶带的分布频率依次为：16.7%、33.3%、33.3%、11.1%、5.6%、11.1%、16.7%、5.6%、11.1%、77.8%、72.2%、5.6%、61.1%、16.7%、5.6%、22.2%。经分析得出X酶带分布频率最高为77.8%，其次是XI酶带分布频率为72.2%，V、VIII、XII和XV酶带分布频率最小，只有5.6%，说明各个菌株具有一定的遗传相似性。

2.318个蜜环菌菌株种间酶谱聚类分析

2.3.1酯酶同工酶酶谱相似系数(Sc)

根据1.2.3的方法统计计算18株蜜环菌酯酶同工酶谱相似性系数，见表2。结果表明，18个蜜环菌菌株间遗传相似性系数(Sc)为0～1.000之间，相似系数越小，说明两菌株之间的亲缘关系越远。其中，ZY-8、ZY-13、ZY-14与ZY-1、ZY-2、ZY-3、ZY-4，ZY-12、ZY-16、ZY-17、ZY-18与ZY-3、ZY-4的相似系数仅为0，说明它们的无亲缘关系，并与其它菌株的相似性系数大多数分布在0.200～0.400之间，亲缘关系很远。ZY-1和ZY-2，ZY-6、ZY-9和ZY-11，ZY-5和ZY-10，ZY-13和ZY-14，ZY-16、ZY-17和ZY-18的相似系数为1.000说明它们可能是源于同一种，甚至是亲缘关系很近的变异类型。

2.3.2聚类分析

根据酯酶同工酶电泳结果，在凝胶的某个相同的迁移率位置上有条带的记为1，无条带的记为0，用NTSYS-pc软件算出菌株间的遗传相似系数，并应用其平均连锁聚类分析方法进行聚类分析(图3)。聚类分析树状图表明，ZY-10和ZY-5，ZY-1和ZY-2，ZY-6、ZY-9和ZY-11，ZY-16、ZY-17和ZY-18，ZY-13和ZY-14相似性系数为1，说明其亲缘关系极其相似；ZY-10、ZY-5和ZY-7的相似性系数较大，说明两个菌株之间亲缘关系比较近；ZY-16、ZY-17、ZY-18和ZY-7的相似性系数较大，说明两个菌株之间亲缘关系比较近；ZY-1、ZY-2和ZY-6、ZY-9、ZY-11的相似性较大，说明两菌株之间亲缘关系比较近。ZY-13、ZY-14、ZY-8和ZY-1、ZY-2、ZY-3、ZY-4的相似性系数为0，说明ZY-13、ZY-14、ZY-8和ZY-1、ZY-2、ZY-3、ZY-4的亲缘关系比较远。

表2　18株蜜环菌酯酶同工酶酶谱的相似系数

图3　18株蜜环菌的酯酶同工酶聚类分析树状图

3讨论

同工酶是基因表达的产物，也是分子水平的表现型。因此，利用同工酶进行遗传分析具有一定的可靠性与可行性。在酯酶同工酶电泳试验中，由于菌株的酯酶同工酶和其形态特征一样，都是菌株的基因型和环境效应互相互作用的综合表现的结果。因此，在应用其进行物种品种鉴别、种质鉴定等有关研究工作中，只有选择一致的培养时间和培养基等条件，采用标准统一的测试程序进行分析，建立食用菌菌株酯酶同工酶的标准酶谱，才能保证酯酶同工酶的稳定性和可重复性。

由于酯酶同工酶的表现型差异反映了基因型的差异，从而可以从菌株基因型的差异程度就能显示出种间亲缘关系的远近。Vaughan在1968年提出中间亲缘关系可以用酶谱相似度进行预料，不同菌株之间的相似性系数越大，表明物种间有着较小的酶谱差异，亲缘关系越近[14]。此次试验的18株蜜环菌均是秦巴地区出现或是当地从事种植的蜜环菌品种，从18个蜜环菌菌株酯酶同工酶的酶谱分析表明，每种菌都具有各自的特征性酶带，有些菌株的酶谱存在较大的差异性，例如ZY-8、ZY-13、ZY-14和ZY-1、ZY-2、ZY-3、ZY-4；ZY-12、ZY-16、ZY-17、ZY-18和ZY-3、ZY-4的相似系数最低，说明它们之间亲缘关系较远。而ZY-1和ZY-2，ZY-6、ZY-9和ZY-11，ZY-10和ZY-5，ZY-13和ZY-14，ZY-16、ZY-17和ZY-18酶谱存在很大的相似性，说明这些菌株间的亲缘关系较近，且部分菌株可能源于同一种或为亲缘关系很近的变异类型。

通过对蜜环菌菌株酯酶同工酶的研究并构建聚类分析树状图。ZY-13、ZY-14和ZY-8与其它菌株的亲缘关系比较远，可作为原生质体制备、融合及再生的优势菌株，为筛选优良的蜜环菌品种的遗传育种奠定理论基础。

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[责任编辑：谢 平]

Study on esterase isozyme ofArmillariamelleain Qinba mountainous area

YANG Hai-xu1,DENG Bai-wan1,2,CHEN Wen-qiang1,2,YU Xiao-yan1,XIE Xiu-chao1,2

(1.School of Bioscience and Engineering, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723000, China；2.Shaanxi Engoneering Research Center of Edible and Medicated Fung, Hanzhong 723000, China)

Abstract:Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) was adopted to study esterase isoenzyme in 18 different Armillaria mellea strains. Ioenzyme bands between 1～7 were identified from each strain.Similarity coefficient values for the 18 strains range from 0 to 1.000, with the similarity index between Jing234-1 and Jing234-2,M-8,A-9 and Shouxian,Jing234-5 and A-12,Dongbei-5 and Dongbei-4,Yunnan-1, Yunnan-2 and A13 being 1.000, indicating that these kinds are of close relative relationship. The similarity index between M-15, Dongbei-5 and Dongbei-4 and Jing234-1, Jing234-2, Jing234-3, Jing234-4；Chenggu, Yunnan-1, Yunnan-2 and A13 and Jing234-3, Jing234-4 being only 0.

Key words:Armillaria mellea；esterase isoenzyme；electrophoresis

[中图分类号]Q949.329+.81

[文献标识码]A

作者简介：杨海旭(1987—),男，陕西省宝鸡市人，陕西理工学院硕士研究生，主要研究方向为微生物资源开发利用；[通信作者]邓百万(1963—)，男，陕西省眉县人，陕西理工学院教授，主要研究方向为微生物资源保护与开发利用；陈文强(1956—)，男，陕西省洋县人，陕西理工学院教授，硕士生导师，主要研究方向为微生物资源的保护与利用。

基金项目：陕西省科技厅科技统筹创新计划项目(2012HBGC-20)；陕西理工学院人才引进启动项目(SLGKYQD2-19)

收稿日期：2015-10-08修回日期：2015-12-24

[文章编号]1673-2944(2016)02-0051-06