miRNA-100对胃癌细胞侵袭迁移力及放射敏感性的影响

徐迎迅　杨　成

1 滨州医学院基础医学院人体解剖学教研室　烟台　264003；2 菏泽市立医院分院普外科



miRNA-100对胃癌细胞侵袭迁移力及放射敏感性的影响

徐迎迅1,2杨成1

1 滨州医学院基础医学院人体解剖学教研室烟台264003；2 菏泽市立医院分院普外科

【摘要】目的探究miRNA-100对胃癌细胞NCI-N87侵袭转移能力及放射敏感性的影响。方法实时荧光定量PCR定量检测miR-100在NCI-N87细胞中的表达量。克隆形成实验、MTT实验、Transwell侵袭实验、流式细胞仪、细胞划痕实验及Western blot检测miR-100对胃癌细胞NCI-N87放射敏感性、增殖、侵袭、凋亡、迁移及侵袭相关蛋白的表达的影响。结果实时荧光定量PCR结果显示miR-100在NCI-N87细胞中的表达明显改变；克隆形成实验、MTT实验、Transwell侵袭实验、流式细胞仪、细胞划痕实验及Western blot结果证实miR-100可抑制NCI-N87细胞增殖、侵袭、迁移及侵袭相关蛋白的表达，促进细胞凋亡，提高其辐射敏感性。结论miR-100可抑制NCI-N87细胞的生长增殖侵袭迁移能力，促进其凋亡，且提高其辐射敏感性。

【关键词】miR-100；NCI-N87；放射敏感性；侵袭；转移

胃癌是威胁我国人民生命健康的最主要恶性肿瘤之一，虽然近年来胃癌的发病率和死亡率有所下降，但仍分别居恶性肿瘤的第2位和第3位[1，2]。虽然传统意义上手术治疗的规范化及新型抗肿瘤药物的研发对胃癌的治疗取得了长足的进步，但对于大部分可手术的局部进展期胃癌或者不可根治的转移性胃癌的诊治仍有许多疑难点困扰我们，术后五年生存率仅30%左右。其临床生理病理改变复杂多变且机理尚未探明。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类内生的、长度为20～24个核苷酸的非编码单链小分子RNA，在转录后水平通过调节mRNA的翻译来调控靶基因的表达,通过调控多种通路的靶基因参与多种生物学信号通路的调节[3，4]。肿瘤细胞的放射敏感性与蛋白编码基因的异常表达、包括miRNA在内的非编码RNA的调节密切相关[5，6]本实验通过克隆形成实验、MTT实验、Transwell侵袭实验、流式细胞仪、细胞划痕实验及Western blot检测转染miR-100模拟体、抑制剂及阴性对照后的胃癌细胞侵袭迁移能力及辐射敏感性的变化。

1.1材料和试剂人胃癌细胞系NCI-N87购自中国科学院上海细胞库并由本实验室冰冻保存，生长培养基为含10%胎牛血清(FBS)DMEM的培养基。按转染条件不同分为mimimc、inhibitor 和nc组。DMEM培养基、胎牛血清及青霉素/链霉素双抗购自美国Thermo公司；miR-100模拟体、抑制剂及阴性对照剂由上海吉玛制药技术有限公司合成；MMP-2、MMP-9及GAPDH抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.2方法

1.2.1细胞转染取密度适宜对数生长期细胞，无酶EP管以DMEM 培养基配制转染试剂及miR-100合成产物，5 min内混匀，静置20 min,细胞无血清DMEM培养基换液，加转染复合体，4～6 h换含10%血清DMEM 培养基37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

1.2.2Real-time PCR胰酶消化收集细胞，加TRIzol裂解提取RNA，测浓度后逆转录合成CDNA，实时荧光定量PCR检测miR-100相对表达量。以2^-△△CT表示肿瘤细胞转染miR-100mimic、inhibitor后表达量相对于转染阴性对照后miR-100表达量的变化倍数。

1.2.3MTT实验对数生长期细胞1×103～4个细胞/孔接种于 96孔板，设5个平行孔，培养24 h，每孔加入 MTT溶液 100 μL，37℃ 4 h，每孔加200 μL DMSO，震荡10 min，测 490 nm处OD值。计算各组细胞的增值能力。

1.2.4克隆形成实验以200、300、3 000、5 000、8 000细胞数接种六孔板，分别给予0、2、4、6、8 Gy辐射处理，37 ℃、5% CO2孵育2周，洗涤，固定，Giemsa 染色，计数，计算克隆形成率及辐射增敏比。

1.2.5细胞凋亡检测收集细胞培养液及细胞，离心，染色缓冲液重悬细胞，避光加入PI和Annexin V试剂，室温孵育 15～30 min，于流式测定管中上机检测分析。

1.2.6Western blot提取细胞蛋白，绘制标准曲线，40 μg上样量上样，电泳，转膜，封闭，一抗4℃孵育过夜，洗膜，二抗室温孵育1 h，洗膜，曝光，结果分析。

1.2.7Transwell侵袭实验实验前Matrigel基质胶4℃预冷成液态，枪头预冷，DMEM培养基1∶5稀释Matrigel基质胶，每小室50 μL，37℃ 1 h，0.5% BSA培养基重悬细胞至5×105/ml，每孔100 μL，500 μL含10% FBS的DMEM培养基加入24孔板下室，培养24 h，洗涤2遍，甲醇固定 30 min，Giemsa染液染色 30 min，棉签擦去上层基质胶和未迁移的细胞，细胞计数。

1.2.8细胞划痕实验细胞生长至接近饱时用无菌的 200 μL枪头于标记位置划出等宽的直线划痕，清洗，无血清DMEM培养基培养24 h，显微镜下观察划痕的宽度,拍照对比分析。

2结果

图1细胞转染 miR-100 mimics，inhibitor图2miR-100对细胞增殖能力的影响

2.1实时荧光定量PCR验证 NCI-N87细胞中miR-100转染效果如图1所示：NCI-N87细胞转染miR-100 mimic细胞组miR-100的相对表达量明显高于转染 miR-100 NC组，两组对比差异有统计学意义(P<0.01)；相反，NCI-N87细胞转染miR-100 inhibitor组miR-100的相对表达量明显低于转染miR-100 NC细胞组，P<0.01，两组对比差异有统计学意义。结果表明，化学合成的成熟 miR-100可以有效的转染入NCI-N87细胞，能显著提高或降低转染细胞中miR-100的表达量。

及阴性对照后miR-100相对表达量

2.2miR-100抑制NCI-N87细胞增殖我们通过MTT实验验证转染miR-100对胃癌增殖能力的影响。实验结果如图2所示，与转染 NC细胞组(0.862±0.043)相比，转染 miR-100 mimic细胞组(0.685±0.023)的增殖力明显下降，P<0.01，差异有统计学意义；而转染miR-100 inhibitor组(1.112±0.059)的增殖力明显提高，P<0.01，差异有统计学意义。

2.3 miR-100降低NCI-N87细胞侵袭迁移能力我们通过划痕实验、Transwell、及western blot从实验现象及基因层面上验证miR-100对胃癌细胞侵袭迁移能力的影响。如图3所示，NCI-N87细胞划痕后 48 h miR-100 mimic细胞组划痕条带愈合速度明显慢于 NC组；相反，细胞转染 miR-34a inhibitor细胞组的划痕条带愈合速度则快于NC组(图3 A)。转染miR-100 mimic细胞组(14.67±2.03)平均每视野(×20)穿出小室的细胞数与NC细胞组(23.67±1.76)相比显著减少(P<0.05)，差异有统计学意义。转染 miR-100 inhibitor (31.67±1.67)组显示每视野(×20)穿出小室的细胞数相对增加(P<0.05)，差异有统计学意义(图3B)。此外，Western blots对MMP-2、MMP-9的蛋白水平变化进行检测发现，MMP-2、MMP-9的表达水平与 miR-100的表达量呈负相关(图3 C)。

2.4miR-100促进NCI-N87细胞凋亡我们通过流式细胞术检测miR-100对胃癌细胞凋亡的影响，结果如图4所示，与对照组(13.95±0.72)相比，转染miR-100 mimic细胞组(20.05±1.23)的凋亡率增加，差异有统计学意义(P<0.05)；相反，转染miR-100 inhibitor细胞组(8.60±0.63)的凋亡率则相应的减少，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.5miR-100提高NCI-N87细胞克隆辐射敏感性克隆形成实验结果显示，相较于阴性对照组而言，细胞转染miR-100mimic后辐射敏感性显著增强；而转染miR-100 inhibitor后辐射敏感性显著降低，见表1。

表1　miR-100对NCI-N87细胞辐射敏感性的影响

注：D0为平均致死量；Dq 为准阀剂量；SER为辐射增敏比。

3讨论

miRNA在细胞分裂、增殖、分化、凋亡以及癌症形成中发挥着巨大的作用。miRNA测定相关研究揭示不同类型癌症中miRNA水平异于正常,进一步研究证明相关的异常miRNA基因位于癌症相关的畸变基因组。大约有30%的蛋白编码基因是由miRNA调控的[7]。它可以通过诱导RISC绑定到目标基因来达到阻止或延迟靶基因翻译的作用[8]。许多研究探讨过胃癌中miRNA的表达谱，在弥散型胃癌中miR-105、miR-100、miR-125b、miR-199a、miR-143、miR-145以及miR-133a均是高表达的[9]。与正常组织相比，在未分化胃癌组织中miR-34b、miR-34c及miR-128a是显著上调的而miR-128b、miR-129及miR-148表达量显著降低[10]。这些在肿瘤组织中异常表达的miRNA可能作为肿瘤的预后指标或者诊断生物标志物以区分与正常组织。以上研究都证明miRNA参与了癌症的发生发展并有可能成为一个新的诊断标准和治疗靶点。

对于胃癌来讲，临床多手段多学科结合治疗已成为一种共识，而放射治疗是肿瘤治疗中的重要手段之一。放射治疗目的在于控制疾病进展，缩小病灶范围，为手术创造良好条件。然而由于放射抵抗及肿瘤周边危及器官耐受量低限制剂量增大等因素往往使放射治疗收效甚微甚至失败，因此，如何克服辐射抵抗，有效的增强胃癌放疗敏感性，提高放射治疗疗效，并寻找新的治疗突破点，对于改善患者生存与生活质量具有重要意义。有研究表明，胃癌细胞的放射敏感性与miRNA等非编码RNA的调节密切相关。miRNA可通过调控肿瘤细胞的EMT来影响肿瘤细胞特性，这种机制可能会在很大程度上影响胃癌的放射敏感性。此外，外泌体介导的miRNA表达水平的变化也发挥着重要作用。

miR-451和miR-221/222 的过表达能够增强胃癌细胞AGS7901的辐射敏感性通过靶向结合MIF和PTEN[11]。对miRNA及涉及肿瘤放射敏感性相关通路研究的深入为现有的放射治疗的改进和发展提供了理论支持和技术支持，但由于放射治疗涉及面广，机制复杂，目前关于提高胃癌细胞放射治疗的方法仍较局限，miRNA调节胃癌细胞辐射敏感性的具体机制仍需深入探究。

本研究通过将miR-100模拟体、抑制剂及阴性对照剂转染入胃癌细胞中人为调节miR-100的表达来观察miR-100对细胞放射敏感性、增殖、侵袭、凋亡、迁移及侵袭相关蛋白的表达的影响。结果证实miR-100可抑制NCI-N87细胞的生长，促进其凋亡，并且抑制NCI-N87细胞的侵袭迁移能力，提高其辐射敏感性。目前关于miR-100对胃癌发生发展及治疗的研究仍处于初级阶段，从基因水平探索miRNA对肿瘤侵袭迁移力及辐射敏感性的影响为肿瘤的临床治疗提供了新的切入点。

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Effect of miR-100 on the invasion,migration and radiosensitivity of gastric cancer cells

XU Yingxun1,2YANG Cheng1

1 Department of Anatomy,School of Basic Medical Sciences,Binzhou Medical University, Yantai 264003, P.R.China;2 Department of General Surgery, Branch Hospital of Heze Municipal Hospitial

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of miR-100 on the invasion,migration andradiosensitivity of NCI-N87 cells.MethodsThe mature type human miR-100 was synthesized chemically.The synthesized miR-100 was transfected into NCI-N87 cells via Lipofectamine-2000. The expression of miR-100 was detected by real-time PCR.MTT assay was used to investigate the function of miR-100 on the proliferation of NCI-N87 cells. Colony-forming assay was used to study the effect of miR-100 on the radio sensitivity of NCI-N87 cells.Flow cytometry was conducted for the detection of cell apoptosis.The invasion of NCI-N87 cells was investigated with Transwell Chamber assay.The metastasis of NCI-N87 cells was detected with cell scratch assay.The expression levels of MMPs were detected with Western blot.ResultsIn order to confirm the biological effects of miR-100 during the development of gastric carcinoma, we synthesized human miR-100 mimic and miR-100 inhibitor, which was transfected into gastric cancer cell lines.Increased miR-100 expression suppressed cell growth,while overexpression of miR100 significantly promoted apoptosis by flow cytometry. Colony-forming assay showed that miR-100 could greatly enhance the radiosensitivity of NCI-N87 cells.Through wound healing test and Transwell migration assay,we observed that transfection of human miR-100 mimic,reduced the migration ability compared with the control group.On the contrary,the function was oppositive treated with miR-100 inhibitor. The expression of MMP-2 and MMP-9 were inhibited showed by Western blot.ConclusionsMiR-100 can inhibit the ability of migration, invasion and proliferation and promote the apoptosis and radiosensitivity of NCI-N87 cells.

【Keywords】miR-100, NCI-N87,radiosensitivity,invasion,migration

(收稿日期：2015-10-26)

【中图分类号】R34

【文献标志码】A

【文章编号】1001-9510(2016)02-0096-04

通讯作者：杨成，E-mail: yangchxn@163.com1材料和方法