烟草黑胫病菌对7种杀菌剂的敏感性

朱流红，安启菲，吴轶凡，龙友华，赵赞伟，尹显慧*

(1.贵州大学 作物保护研究所，贵州 贵阳 550025；2.毕节市烟草公司大方县分公司，贵州 大方 551600)



烟草黑胫病菌对7种杀菌剂的敏感性

朱流红1，安启菲2，吴轶凡2，龙友华1，赵赞伟1，尹显慧1*

(1.贵州大学 作物保护研究所，贵州 贵阳 550025；2.毕节市烟草公司大方县分公司，贵州 大方 551600)

摘要：采用7种杀菌剂对烟草黑胫病菌室内毒力，并通过对比EC50的方法得出烟草黑胫病菌的抗性水平。结果表明：在7种杀菌剂中，1%的申嗪霉素SC对烟草黑胫病菌的毒力最强，其EC50值为0.0684 μg/mL；其次为40%氟硅唑EC，EC50值为0.1276 μg/mL。70%丙森锌WP对烟草黑胫病菌的毒力最差，其EC50值为85.4334 μg/mL。根据结果得出烟草黑胫病菌对1%的申嗪霉素SC和40%氟硅唑EC表现敏感且抗性水平范围均小于1 μg/mL;对70%丙森锌WP已达到高抗水平且抗性水平范围大于100 μg/mL。

关键词：烟草黑胫病；杀菌剂；毒力测定；敏感性

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1培养基

马铃薯葡萄糖培养基(PDA):称取去皮马铃薯200 g，加无菌水1000 mL煮沸半小时；滤去残渣，向滤液中加入葡萄糖20 g，琼脂18 g，待葡萄糖和琼脂溶解后加水定容至1000 mL，分装在三角瓶中。将三角瓶在0.103 Mpa、121℃下高压灭菌20 min。

1.1.2供试菌株

在贵州省惠水县烟草基地采集烟草黑胫病染病烟株，室内分离纯化。

1.1.3试验药剂

供试药剂、生产厂家及有效成分处理浓度见表1。

称取长柄扁桃粕（苦杏仁苷质量含量5.67%，野黑樱苷未检出）10份，每3份作为一组，三组分别加入2.5、5.5、10.0 mg的苦杏仁苷标准品，再分别加入0.1、0.2、0.5 mg的野黑樱苷标准品，1份留做空白，按照1.2.3.2方法处理，液相测定。计算长柄扁桃粕中平均加标回收率，结果见表1。

1.2试验方法

1.2.1病原菌的分离纯化方法

在贵州省惠水县烟草基地采集烟草黑胫病染病烟株，按照常规的组织分离方法进行分离[12],在新鲜病株的病健交接处切取一定大小的病组织，用70%的酒精消毒10 min，再用无菌水反复浸洗，用无菌剪刀将病组织块剪成小块，置于PDA平板上，于25℃左右恒温箱中培养4 d后，待分离物长出明显的白色菌丝，挑取边缘的白色菌丝，进行分离纯化[13]，将纯化2-3次后的病原菌转于PDA斜面培养基中于4℃冰箱中保存。

1.2.2病原菌致病力测定方法

用分离的纯菌株在PDA培养基上培养6 d，用直径为0.5 cm的无菌打孔器打取菌饼，把菌饼粘于新鲜健康的刺伤的寄主烟草植株上(用75%酒精对其植株表面消毒)，外面遮盖一层用无菌水侵泡过的脱脂棉保湿，以无菌水脱脂棉保湿作对照，然后将接种的盆栽置于25℃左右的温室内培养，将分离的病原菌接种到30株健康植株上，每隔1 d观察1次。发现24株植株发病，记载发病情况和观察病斑菌丝体，并对接种成功的病斑进行组织分离，确认致病菌株。

1.2.3黑胫病菌对药剂的敏感性测定方法

采用菌丝生长速率法测定[14]。根据预实验结果，将供试药剂稀释成不同系列浓度的溶液(见表1)。在无菌操作条件下，每种药剂先配制好比供试浓度高10倍的母液，然后以1∶9的比例与培养基混合均匀，即得系列浓度梯度的含药培养基，以无菌水作空白对照。每皿为此种处理的一次重复，每个处理重复3次。将培养6 d的烟草黑胫病菌株用内径为0.5 cm的无菌打孔器沿菌落边缘打取菌饼，用接种针将菌饼转接到各含药平板中央，28℃培养待对照组菌落长满时，用十字交叉法测菌落直径，运用农药室内生物测定数据处理系统软件[15]算出各种杀菌剂对烟草黑胫病菌的抑制中浓度EC50、95%置信区间及相关系数R。

1.2.4烟草黑胫病菌对供试杀菌剂抗性水平的比较

病原菌对供试杀菌剂(活体生物菌剂除外)的抗性划分，参照张建军等[16]的方法并做了一定调整，具体如下：敏感(S)，EC50<1 μg/mL；低抗(LR)，1 μg/mL100 μg/mL。

表1　各供试药剂及浓度梯度

注：2亿活孢子/g木霉菌WP 和0.2亿/g地衣芽孢杆菌的浓度单位是10×108亿/g，其余杀菌剂的浓度单位μg/mL。

2结果与分析

2.1烟草黑胫病的症状

该病在烟草生长各个时期均有发生，柯赫氏法则发现病株叶片自下而上依次变黄，逐渐全株叶片凋萎，病部表面长出一层稀疏的白毛，此为病原菌的菌丝体。剖开病茎，髓部呈黑褐色，干缩成碟片状，碟片之间有稀疏棉絮状的菌丝体。

2.2烟草黑胫病菌分离纯化和病原物确定

试验共分离出9株菌株，均能使烟草健康植株发病。植株症状表现在叶片自下而上依次变黄，逐渐全株凋萎，病部表面长出一层稀疏的白色菌丝体，剖开髓部呈黑褐色干缩碟片状。用显微镜观察发病部分菌丝体形状，气生菌丝较细，无色透明，无隔膜，孢子囊顶生或侧生，梨形或椭圆形，顶端有乳头状突起。

2.3杀菌剂对烟草黑胫病菌的室内毒力测定结果

杀菌剂对烟草黑胫病菌的室内毒力测定结果见表2。从表中可以看出，供试的7种杀菌剂对烟草黑胫病菌均表现出一定的抑制作用，其中1%的申嗪霉素SC对病菌的抑制作用最强，EC50值为0.0684 μg/mL；其次40%氟硅唑对烟草黑胫病菌有很好的抑制作用，EC50值为0.1276 μg/mL；50%咪鲜胺锰盐WP的抑制效果一般，EC50值为14.4381 μg/mL；35%苯甲·菌酯SC和70%丙森锌WP对烟草黑胫病菌的抑制效果较差，EC50值分别为201.5449 μg/mL和851.8861 μg/mL；2亿活孢子/g木霉菌WP 和0.2亿/g地衣芽孢杆菌活体真菌类微生物杀菌剂，其EC50为活孢子浓度。

2.4烟草黑胫病菌对供试杀菌剂抗性水平的比较

病原菌对供试杀菌剂的抗性水平见表3。从表中可以看出，病原菌对1%申嗪霉素SC、40%氟硅唑EC表现敏感， 抗性水平范围小于1 μg/mL； 对50%咪鲜胺锰盐WP、35%苯甲·菌酯SC、70%丙森锌WP均表现一定抗性，对50%咪鲜胺锰盐WP表现中抗水平，抗性水平范围在10～100 μg/mL之间；对35%苯甲·菌酯SC和70%丙森锌WP已达到高抗水平，抗性水平范围大于100 μg/mL。

表3　各种杀菌剂对烟草黑胫病菌的抗性水平

3讨论

烟草黑胫病是烟草生产过程中的重要病害，化学防治仍然是当今乃至今后一段时期内比较有效的防治手段[17]。本实验采用菌丝生长速率法测定7种杀菌剂对烟草黑胫病菌菌丝生长的抑制作用，从中筛选出了1%申嗪霉素SC、40%氟硅唑EC、50%咪鲜胺锰盐WP和2亿活孢子/g木霉菌WP四种对烟草黑胫病菌有较好抑制效果的药剂，其中1%申嗪霉素SC和40%氟硅唑EC的抑菌效果最佳，其EC50值分别为0.0684 μg/mL和0.1276 μg/mL。50%咪鲜胺锰盐WP和2亿活孢子/g木霉菌WP次之，EC50值分别为14.4381 μg/mL和85.4334 μg/mL。

表2　不同杀菌剂对烟草黑胫病菌毒力测定结果

1%申嗪霉素SC是由荧光假单胞杆菌分泌的一种抗菌素，主要有效成分是吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid)，其主要是利用吩嗪-1-羧酸还原能力，在真菌细胞内积累活性氧，抑制线粒体中呼吸传递链的氧化磷酸化，从而抑制菌丝的正常生长，引起植物病原真菌菌丝体的断裂、肿胀、变形和裂解[18]。近年来甲霜灵在贵州使用已造成烟草黑胫病菌抗药性的产生，然而1%申嗪霉素SC在贵州刚刚投入使用，且在本实验中发现对烟草黑胫病菌的抑菌效果较好。可以将1%申嗪霉素SC和甲霜灵交换使用来减缓抗药性的进一步发展。

氟硅唑(Flusilazole)是美国杜邦公司开发的含硅内吸性三唑类杀菌剂，为甾醇脱甲基化抑制剂，能破坏和阻止病菌麦角甾醇的合成，导致细胞膜不能形成，使病菌死亡[19]。对子囊菌纲和半知菌类真菌有效，目前用于防治葡萄黑痘病、果树及瓜果类黑星病、白粉病等[20]。被用于防治烟草黑胫病菌还比较少见，因此烟草黑胫病菌对其表现敏感。由于其半衰期短、易降解、内吸性较强、对作物安全等特点，在农业中也被广泛使用。

木霉菌主要用于防治各类植物的土传病害, 以及部分叶部和穗部病害，不仅能防病，还具有促进植物生长、提高营养利用效率，增强植物抗逆性和修复农化污染环境等功能[21]。虽然在本实验中2亿活孢子/g木霉菌WP对烟草黑胫病菌抑菌效果一般，但可以在防病的同时也对植物生长提供帮助，增强植株的抵抗能力。烟草黑胫病菌对50%咪鲜胺锰盐WP已表现出中抗水平，应引起重视，在生产中要注意交替使用。

35%苯甲·菌酯SC和70%丙森锌WP表现出高抗水平，应停止使用或限制使用该药剂以及与其有交互抗性的药剂，并应换用新的杀菌剂或与其没有交互抗性的药剂品种，以延缓烟草黑胫病菌抗药性的进一步发展。0.2亿/g地衣芽孢杆菌WP抑菌效果较差，其EC50值562.3432 μg/mL，不建议在田间使用。

研究发现，杀菌剂的混用可以同时降低抗药性菌株和敏感菌株的生长速率，从而达到延缓病原菌抗药性群体的形成，而某一种杀菌剂的单独使用则会增加抗药性发生的风险[22]。因此，在生产过程中应减少单剂的使用并对田间进行抗药性监测及治理研究。且为了延缓烟草黑胫病菌对农药抗药性的产生，建议将1%申嗪霉素SC、40%氟硅唑EC、50%咪鲜胺锰盐WP和2亿活孢子/g木霉菌WP四种农药与其他作用机制不同的杀菌剂交替使用或混合使用。

参考文献

[1]中国烟草总公司云南省公司, 云南省玉溪烟草栽培学校编. 烟草病虫害及防治[M]. 昆明: 云南科技出版社, 1996.

[2]胡艳, 王开运, 许学明, 等.烯酰吗啉对我国烟草黑胫病菌的毒力研究[J]. 农药学学报, 2006, 8(4): 339-343.

[3]马国胜, 高智谋, 曹舜. 烟草黑胫病菌的寄主范围[J]. 中国农业科学, 2012, 45(5): 867-876.

[4]Van Breda de Haan .De bibitziekte in de Deli-tabak, veroorzaakt door Phytophthora nicotianae [J]. Slands Plentuim, 1896 (15):1-107.

[5]陈瑞泰, 朱贤朝, 王智发, 等. 全国16个主产烟省(区)烟草侵染性病害调研报告[J]. 中国烟草科学, 1997, 1(4): 1-7.

[6]苏德成. 烟草病虫害[M]. 北京: 中国财经出版社, 1992: 87-92.

[7]李斌, 龚国淑, 周修勇, 等.6种杀菌剂对烟草黑胫病菌的毒力测定[J]. 烟草科技, 2009(1): 54-56.

[8]袁宗胜. 烟草黑胫病菌对甲霜灵的敏感性测定[J]. 中国烟草科学, 2001(4): 9-12.

[9]Show H D. Response of Phytophthora parasitica var. nicotianae to metalaxy exposure[J]. Plant Disease, 1985(69): 559-562.

[10]马国胜. 烟草黑胫病菌生理生态及对甲霜灵抗性监测与遗传研究[D]. 合肥：安徽农业大学, 2002: 86-87.

[11]彭丽娟, 丁海霞, 陆铮铮. 贵州烟草黑胫病菌对甲霜灵的抗药性测定[J]. 贵州农业科学, 2004, 42(8): 92-95.

[12]方中达. 植物研究方法[M]. 北京:中国农业出版社, 1998: 122-125.

[13]刘芬, 黄琼, 秦西云, 等.不同杀菌剂对烟草疫霉菌的室内毒力测定[J]. 江西植保, 2011, 34(3): 100-101.

[14]慕立义. 植物化学保护研究方法[M]. 北京:中国农业出版社, 1994: 76-81.

[15]司升云, 蔡定军, 吴仁峰, 等. 农药室内生物测定数据处理系统[CP/DK]. 武汉市蔬菜科学研究所, 2006.

[16]奉代力, 王强, 郑纪慈, 等. 几种杀菌剂对番茄灰霉病菌的抑菌效果对比研究[J]. 浙江农业学报, 2013, 25(1): 119-123.

[17]李斌, 龚国淑, 姚革, 等. 烟草黑胫病化学防治研究进展[J]. 广西农业科学, 2008, 39(3): 331-334.

[18]侯昌亮, 艾爽, 胡寒哲, 等. 申嗪霉素和咪鲜胺混配对小麦赤霉病的协同杀菌作用[J]. 农药, 2014, 53(1): 58-60.

[19]陈福良, 王仪, 郑斐能, 等. 40%氟硅唑微乳剂的研制[J]. 农药, 2004, 43(12): 544-546．

[20]燕惠民, 谭济才. 湖南省农业环境和农产品污染状况及其治理对策[J]. 湖南农业科学, 2004(6): 45-47.

[21]AKHTER W，BHUIYAN MKA， SULTANA F，et al.Integrated effect of microbial antagonist,organic amendment and fungicide in contrdling seedlin mortality(Rhi20ctonia aolani) and improving yield in pea(Pisum sativum L.)[J].Comptes Rendus Bidogies, 2014(338):21-28.

[22]Cohen Y, Samoucha Y. Competition between oxadixyl-sensitive and -resistant field isolates of Phytophthorain infestants on fungicide-treated potato crops[J]. Crop Protection, 1990(9): 15- 20.

Determination on Sensitivity ofPhytophthoraNicotianaetoSeven Fungicides

ZHULiu-hong1,ANQi-fei2,WUYi-fan2,LONGYou-hua1,ZHAOZan-wei1,YINXian-hui1*

(1.InstituteofCropProtection,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China; 2.DafangBranchofBijieTobaccoCompany,Dafang,Guizhou551600,China)

Abstract:The toxicity of seven fungicides against Phytophthora nicotianaewere determined by colony diameter method in laboratory, and the resistance level was evaluated by the method of contrast EC50of Phytophthora nicotianae.The results showed that 1% phenazino -1- carboxylic acid SC gave the best toxicity against P. nicotianae, whose EC50value was 0.068 μg/mL. The second one was 40% flusilazole EC, whose EC50value was 0.1276 μg/mL. The worst effect was obtained from 70% propineb WP,whose EC50value was 85.4334 μg/mL. Therefore, 1% phenazino -1- carboxylic acid SC and 40% flusilazole EC were effective for P. nicotianae prevention, and the resistance level were less than 1 μg/mL. Also, 70% propineb WP demonstrated a high resistance level, and the resistance level was greater than100 μg/mL.

Key words:Phytophthora nicotianae, Fungicides, Toxicity determination, Sensitivity

文章编号：1008-0457(2016)01-0018-05国际DOI编码：15958/j.cnki.sdnyswxb.2016.01.005

中图分类号：S482.2

文献标识码：A

*通讯作者：尹显慧(1978-)，女，博士，副教授，主要研究方向：有害生物绿色治理及农产品质量安全；E-mail: 16678192@qq.com。

基金项目：中国烟草总公司贵州省公司科技项目“大方县烤烟病虫害生物防治技术推广应用”(201425)；中国烟草总公司贵州省公司科技项目“前茬除草剂残留对烤烟生长影响及削减技术研究”(201508)。

收稿日期：2015-12-04；修回日期：2016-02-04