龙葵中产皂苷类内生真菌的分离与筛选

刘浪浪，张　云，李端琢，吴　伟

(湖北理工学院 医学院，湖北 黄石 435003)



龙葵中产皂苷类内生真菌的分离与筛选

刘浪浪，张云，李端琢，吴伟*

(湖北理工学院 医学院，湖北 黄石 435003)

摘要：以传统药用植物龙葵为实验材料，分离筛选能产生皂苷类活性成分的内生真菌。通过组织分离法，从龙葵的组织中分离得到24株内生菌。发酵实验结果表明，产皂苷类活性物质的菌株数共有8株，通过物理化学方法验证皂苷类物质主要存在于内生真菌的发酵液中。

关键词：龙葵；皂苷；内生真菌；分离

植物内生菌是指从外观上无任何明显病态的植物组织中分离得到的微生物，包括互惠或中性的内共生微生物，也包括在健康植物体内的某些潜伏的或在一定条件下致病的植物病原微生物[1]。植物内生菌种类繁多，包括细菌、真菌以及放线菌，进入21世纪后研究人员在水稻、玉米等乔本科农作物植物中发现多种具有固氮功能的内生真菌，引起了研究人员的高度重视。现阶段，研究学者关注最多的也是植物中存在的内生真菌，对内生真菌的植物主要有红豆杉、长春花、桃儿七和南海红树等[2-5]。

龙葵草是茄科一年生草本植物，在全国各地均有分布，且种植方便，便于利用。龙葵草中含有多种药用成分，例如甾体皂苷类化合物、黄酮类化合物等，尤其甾体皂苷类化合物，在防治疾病方面具有重要价值，如抗肿瘤、防治心脑血管疾病、降压、消炎、解热、镇痛等[6]，具有极高的药用价值以及开发潜力。目前关于龙葵草中内生微生物的相关报道仅限于内生细菌和放线菌[7]，而对龙葵草内生真菌的生物多样性及药用价值方面研究较少，因此对龙葵草内生真菌的分离方法及次生代谢产物的研究具有较大的研究空间和使用价值[8]。本研究尝试从成熟龙葵草中分离筛选内生真菌，并进行发酵实验，对发酵产物甾体皂苷的产量进行比较和讨论，为利用微生物发酵生产龙葵草药用成分、扩大龙葵草的药用价值奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

龙葵草，采自湖北理工学院植物园。取样后放入密封袋中，24 h内洗净根、茎、叶，用于内生真菌的富集培养及分离。

1.2仪器与设备

RE-3000旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；SHZ-Ⅲ循环水真空泵：上海亚荣生化仪器厂；THZ-D恒温培养箱：太仓市实验设备厂；ZWY-Z40恒温振摇培养箱：上海智城分析仪器制造有限公司；752SP型紫外-可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；HWS26水浴锅：上海一恒科技有限公司；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱：上海姚氏仪器设备厂；SW-CJ-ZD无菌操作台：苏州净化设备有限公司。

1.3培养基的配置

1)LB培养基：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，琼脂5 g，氯化钠5 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2～7.4，121 ℃灭菌25 min，液体培养基不加琼脂。

2)查氏培养基：磷酸氢二钠1 g，硝酸钠3 g，四水合硫酸镁0.5 g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01 g，琼脂30 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2～7.4，121 ℃灭菌25 min，液体培养基不加琼脂[9]。

1.4实验方法

1.4.1龙葵草的预处理

将采集到的新鲜龙葵草洗净，选取健康组织，洗净，剪成2 cm左右小段，置于锥形瓶中备用。

1.4.2龙葵草表面消毒剂的选择

按5点取样法选取叶片中没有虫斑、病斑的健康叶片，剪取2 cm2小叶片，共40片，分为2组，按以下方式做不同处理后培养观察。

1)A组：70%酒精浸泡60 s，3.5%次氯酸钠(有效氯)浸泡3 min，再用70%酒精浸泡30 s，之后用无菌水冲洗3次，每次5 min。

2)B组：70%酒精浸泡60 s，0.1%升汞浸泡1 min，再用70%酒精浸泡30 s，之后用无菌水冲洗3次，每次5 min。

1.4.3龙葵草表面消毒时间的选择

按5点取样法选取叶片中没有虫斑、病斑的健康叶片，剪取2 cm2小叶片，分为6组。首先70%酒精浸泡60 s，然后3.5%次氯酸钠(有效氯)浸泡，再用70%酒精浸泡30 s，最后用无菌水清洗3次，每次5 min。各组实验在3.5%(有效氯)次氯酸钠浸泡时间分别为1，2，3，4，5，6 min。使用移液枪将最后一次冲洗液100 μL置于LB培养基中，28 ℃恒温培养箱培养2～7 d，观察菌落生长情况。

1.4.4内生真菌的分离筛选

龙葵草中内生真菌的筛选过程包括龙葵草根、茎、叶的消化，消化液的培养及内生真菌的纯化与发酵3个阶段。

1.4.4.1龙葵草根、茎、叶的消化

将已表面消毒的龙葵草根、茎、叶置于锥形瓶，再加入含有1%纤维素酶、1%SDS及PBS缓冲溶液，振摇均匀，30 ℃，120 r/min恒温振摇箱中处理1 h。

1.4.4.2消化液的培养

将锥形瓶取出，使用移液枪吸取消化液，分别向查氏培养基中加入100 μL原液、10倍稀释液、100倍稀释液，涂布均匀，并做好空白对照组培养基，将所有培养基转入恒温培养箱中培养2～14 d。

1.4.4.3内生真菌的纯化与发酵

将已筛选出的龙葵草内生真菌划线培养至纯培养，将纯培养转入查氏液体培养基中，每100 mL中约菌饼20块，将锥形瓶移入30 ℃，120 r/min恒温振摇培养箱中培养2～14 d。

1.4.5内生真菌发酵液中皂苷类活性物质的检测

1.4.5.1液体培养基及菌丝的处理

将培养7 d的液体培养基离心、抽滤，收集滤液和菌丝。菌丝置于50 ℃干燥，研磨后用正丁醇浸泡3次，每次24 h，然后50 ℃下减压浓缩，并定容至10 mL。滤液使用正丁醇萃取3次，每次萃取24 h，然后50 ℃下减压浓缩，并定容至10 mL。

1.4.5.2液体培养基中皂苷类活性物质的初步鉴定

1)物理发泡法：取1 mL菌液，加入10 mL水，煮沸10 min，振摇后产生泡沫放置15 min后观察形态，另取带塞试管2只各加发酵液1 mL，一管加5% NaOH 2 mL，另一管加5% HCl溶液2 mL，密塞，振摇1 min，产生大量蜂窝状泡沫，比较加碱管是否比加酸管高2倍以上。

2)化学方法：菌液稀释后加入浓硫酸1滴，观察是否产生色阶变化[7]。

1.4.5.3薯蓣皂苷标准曲线的制备。

精密称取薯蓣皂苷标准品9.985 0 mg，使用甲醇定容于10 mL容量瓶，制成0.999 9 mg/mL薯蓣皂苷-甲醇标准液备用。精密吸取60，120，180，240，300，360 μL置于10 mL容量瓶中，水浴蒸干甲醇溶剂，冷却后加入5%甲醇-冰醋酸溶液0.4 mL，振摇溶解后加入高氯酸1.6 mL，摇匀后放入70 ℃水浴15 min，然后流水冷却，冰醋酸溶液定容，摇匀后放置10 min；相同条件下不加标准品溶液制备空白溶液，用紫外分光光度计于545 nm处测吸光度，制备标准曲线，回归方程为A= 0.0055C+0.0094，R2=0.9947。

1.4.5.4发酵液中皂苷类活性物质的含量测定

将已培养7 d的液体培养基抽滤，分离出菌丝与滤液，作不同处理，处理方法见1.4.5.1。将处理液使用紫外分光光度仪测定吸光度，利用标准曲线计算皂苷类活性物质的含量。

1.4.5.5龙葵草及发酵液中皂苷类活性物质的TLC检测。

1)龙葵草植株干燥粉碎后过80目筛，置于圆底烧瓶中，加去离子水适量于40 ℃恒温箱中发酵24 h，取浓硫酸5 mL逐滴加入并不断摇动，加热回流4 h，再加氢氧化钠调pH值至7左右，抽滤得滤渣，80 ℃干燥2 h，并用石油醚索氏提取至无色，旋转挥发干石油醚并用氯仿溶解，得龙葵草皂苷类活性成分样品溶液1。

2)发酵液使用同体积正丁醇萃取3次，每次24 h，合并萃取液，浓缩，取适量，挥干正丁醇，加入氯仿适量，得龙葵草内生真菌发酵液样品溶液2。

3)取薯蓣皂苷标准品，加入氯仿溶解，得薯蓣皂苷标准溶液。

4)将以上样品溶液1、样品溶液2以及标准品溶液点于已于150 ℃活化1 h硅胶薄层板中，挥去溶剂，转入层析缸，层析液为氯仿-正丁醇-水(15∶5∶1)，显色液为10%硫酸乙醇溶液，105 ℃烘3～5 min，至斑点清晰。

2结果与讨论

2.1龙葵草表面消毒剂的选择

消毒剂消毒效果不好易导致龙葵草表面消毒效果达不到要求，使消化液中混入杂菌；消毒剂消毒效果过强易导致消毒剂渗入植物组织内部，杀死龙葵草内生真菌，影响内生真菌的多样性，所以，消毒剂的选择将直接影响龙葵草内生真菌的筛选过程，实验结果如表1所示。

表1　龙葵草表面用消毒剂的选择

研究结果表明，采用次氯酸钠作为表面消毒剂后其清洗液中杂菌检出率小于使用升汞作为表面消毒剂；观察培养皿中叶片的颜色发现，升汞处理后的叶片颜色明显深于采用次氯酸钠处理后的叶片颜色，升汞处理的边缘有焦黄的颜色，提示采用升汞处理可能处理过量；另外，升汞具有剧毒，且目前还不能证明其在内生真菌的生长过程中有什么作用，所以，综合考虑实验中采用次氯酸钠作为表面消毒的消毒剂。

2.2龙葵草表面消毒时间的选择

龙葵草表面消毒所用时间的选择见表2。表面消毒的效果与消毒剂处理时间的长短有密切的关系，消毒剂处理时间越长，则消毒效果越好；但随着消毒时间增加到一定程度时，表面消毒的效果不再增加，此时再增加消毒剂处理时间，将会增加消毒剂侵染龙葵草组织概率，导致消毒剂影响龙葵草内生真菌的分离，所以，当使用次氯酸钠作为表面消毒剂时，处理时间以5 min为宜。

表2龙葵草表面消毒所用时间的选择

处理时间/min123456检出的菌落数/株27198100

2.3龙葵草内生真菌的筛选结果

经表面消毒的龙葵草组织块或其消化液在培养3～5 d后，逐渐可见有菌丝长出，其结果见表3。

表3龙葵草内生真菌的筛选结果

植物组织原液10倍液100倍液残渣根85210茎4316叶5418

由表3可看出，由龙葵根筛选出的内生真菌数量明显多于茎和叶中筛选出的内生真菌的数量；残渣中存在的内生真菌多于消化液中筛选出的内生真菌；消化液稀释倍数越大，则筛选出的内生真菌的数量越少。

2.4龙葵草内生真菌发酵液中皂苷类活性成分的检测

经物理发泡法及化学方法鉴定筛选出的内生真菌的发酵液，产生明显现象的菌株共有8株，其培养特性见表4和图1。

表48株检出产皂苷类活性物质内生真菌培养特性

菌株号培养特性1菌落为墨绿色,后转为黑色,粉状,基质为黑色。2菌丝初为白色,后转为红色,最后变为黄色,基质颜色随菌丝颜色变化而逐渐变为黄色。3菌落为黄色小的颗粒,有极少、极细的气状菌丝,基质为黄色。4菌丝为白色,逐渐转变为褐色,基质为褐色。5白色菌丝,转为褐色,絮状,生长迅速,基质为褐色。6菌丝为红色絮状,基质为紫红色。7菌丝生长块,4d长满培养皿,基质颜色不变。8白色絮状菌丝,有褐色菌核,质硬,基质颜色不变。

2.5产皂苷类内生菌发酵液中皂苷类活性物质的含量测定

将正丁醇萃取液浓缩，挥干正丁醇溶剂，按1.4.5.4操作步骤操作，于545 nm处测量吸光度，利用回归方程计算皂苷类活性物质的浓度，其结果见表5。

表5产皂苷类内生真菌菌丝及发酵液中皂苷类物质的含量μg/mL

菌株号菌丝发酵液10.042.7420.081.9730.105.4240.053.4850.174.8260.072.1870.186.1780.316.37

由表5可看出，龙葵草产皂苷类活性物质的内生真菌发酵液中皂苷类物质的含量均高于菌丝中皂苷类物质，说明皂苷类物质是初筛菌株的胞外产物。

2.6TLC检测结果

龙葵草及产皂苷类活性物质的内生真菌中皂苷类物质的TLC检测结果见图2。

由图2可看出，龙葵草中存在薯蓣皂苷类化合物，且筛选出的内生真菌的发酵液中也存在薯蓣皂苷类化合物。

3结论

通过研究发现，采用3.5%的次氯酸钠(有效氯)处理龙葵草表面5 min，表面消毒效果良好，且不会影响到内生真菌的筛选过程。此次龙葵草内生真菌的筛选中共筛选出内生真菌24株，其中产皂苷类活性物质的菌株数共有8株，通过物理化学方法对初筛菌株进行验证，发酵实验验证皂苷类物质主要存在于内生真菌的发酵液中，菌丝中的含量较少。

参 考 文 献

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[2]华永丽,欧阳少林,陈美兰,等.药用植物内生真菌研究进展[J].世界科学技术-中医药现代化,2008,10(4):105-111.

[3]谭小明,周雅琴,陈娟,等.药用植物内生真菌多样性研究进展[J].中国药学杂志,2015(18):1563-1580.

[4]邵爱娟,林淑芳,张思巨,等.一种能产生紫杉醇类化合物内生真菌的分离[J].中国医学科学院学报,2001,23(6):642-644.

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(责任编辑吴鸿霞)

Preliminary Isolation and Screen of Endophytic Fungi Producing Saponins from Solanum Nigrum L

LiuLanglang,ZhangYun,LiDuanzhuo,WuWei*

(School of Medicine,Hubei Polytechnic University,Huangshi Hubei 435003)

Abstract：Solanum nigrum L was used as materials to screen endophytic fungi which can produce saponins.24 endophytic fungi were isolated from Solanum nigrum L by tissue surface-sterilized.The results indicated that 8 endophytic fungi can produce saponins, and they were mainly existing in the fermentation broth.

Key words：Solanum nigrum L;saponins;endophytic fungi;isolate

中图分类号：Q932

文献标识码：A

文章编号：2095-4565(2016)02-0056-05

doi:10.3969/j.issn.2095-4565.2016.02.013

*通讯作者：吴伟，讲师，博士，研究方向：生物技术制药。

作者简介：刘浪浪，本科。

基金项目：矿区环境污染控制与修复湖北省重点实验室开放基金项目(项目编号：2012105)；湖北理工学院大学生科技创新项目(项目编号：13cx08)；湖北省教育厅指导性项目(项目编号：B2014023)。

收稿日期：2015-09-24