甘遂半夏汤加减甘遂甘草不同给药次数对腹水大鼠水通道蛋白-2基因及肾凋亡的影响

张建美　许皖　钟赣生　赵桐　范盎然　柳海艳　郭岩松　修琳琳　王思睿

100029　北京中医药大学基础医学院[张建美(硕士研究生)、许皖(硕士研究生)、郭岩松(硕士研究生)、修琳琳(博士研究生)、王思睿(硕士研究生)]，基础医学院方药系(钟赣生、柳海艳)，科研实验中心(范盎然)；中国中医药出版社(赵桐)



甘遂半夏汤加减甘遂甘草不同给药次数对腹水大鼠水通道蛋白-2基因及肾凋亡的影响

张建美许皖钟赣生赵桐范盎然柳海艳郭岩松修琳琳王思睿

100029北京中医药大学基础医学院[张建美(硕士研究生)、许皖(硕士研究生)、郭岩松(硕士研究生)、修琳琳(博士研究生)、王思睿(硕士研究生)]，基础医学院方药系(钟赣生、柳海艳)，科研实验中心(范盎然)；中国中医药出版社(赵桐)

【摘要】目的观察不同给药次数条件下的甘遂半夏汤加减甘遂甘草反药组合对腹水模型大鼠肾脏水通道蛋白(aquaporin, AQP)-2 mRNA 表达及肾组织凋亡的影响。 方法采用Walker-256细胞制造癌性腹水模型，将Wistar大鼠按体质量随机分为空白组、模型组、阳性对照组、全方给药一次组、去草给药一次组、去遂给药一次组、去草遂给药一次组、全方给药二次组、去草给药二次组、去遂给药二次组、去草遂给药二次组，共计11组。给药一次组每天上午给药一次，给药二次组上午下午各给药一次，一二次组每天给药总量一致。腹水长成14天取材，摘取肾脏，液氮保存，进行PCR和免疫组化实验。 结果甘遂半夏汤全方给药一次组和全方给药二次组的AQP-2 mRNA 表达及肾组织凋亡无明显差异。但全方组的AQP-2 mRNA表达及肾组织凋亡均较全方去一味或两味反药组有降低趋势。 结论含甘遂甘草反药组合的甘遂半夏汤全方给药一次组和给药二次组抑制AQP-2 mRNA表达和对癌性腹水造成的肾组织细胞过度凋亡的减缓作用无明显差异，且均优于全方去掉一味或两味反药组。

【关键词】甘遂；甘草；反药组合；水通道-2信使RNA；肾组织凋亡

甘遂半夏汤首载于东汉张仲景的《金匮要略》[1]:“病者脉伏，其人欲自利，利反快，虽利心下续坚满，此为留饮欲去故也，甘遂半夏汤主之。”现代医家主要将其应用于渗出性胸膜炎、肝硬化腹水等症[2]。但由于甘遂半夏汤组方中包含甘遂甘草两味中药，属中药配伍禁忌中相反药物配伍，医家在临床使用过程中多有忌惮，大大限制了其使用。然而近年大量科研工作者的实验表明，甘遂甘草反药组合的使用并不是完全禁忌的，而是受不同条件限制的[3-4]。为此，笔者以癌性腹水大鼠为模型，进行了甘遂半夏汤加减甘遂甘草反药组合对大鼠肾脏水通道蛋白(aquaporin, AQP)-2 mRNA 表达及肾组织凋亡影响的实验研究，以探讨给药次数是否会影响甘遂甘草配伍后产生的毒性和药效，以及该影响是否与反药组合相关。

1材料与方法

1.1实验动物

雄性Wistar大鼠，体质量(200±20)g，SPF级。动物由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号为SCXK(京)2006-0009。

1.2实验药物

醋甘遂为大戟科植物甘遂EuphorbiakansuiT. N. Liou ex T. P. Wang的干燥块根醋制而成，由安徽丰原铜陵中药饮片厂(120301)提供；炙甘草为豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根茎蜜制而成，由安徽丰原铜陵中药饮片厂(120201)提供。法半夏为天南星科植物半夏Pinelliaternate(Thunb) Breit. 的块茎，经甘草和生石灰炮制而成，由安徽丰原铜陵中药饮片厂(100701)提供；白芍为毛茛科植物芍药PaeonialactifloraPall. 的根，自行浸泡、切片、烘干备至实验所需饮片，由磐安科信中药材生产力促进中心提供；呋塞米由江苏安邦艾普森药业有限公司提供(H32021428)提供。

1.3药物制备

阳性药(呋塞米)：给药浓度为4.2 g/kg。药液制备为0.42 g/mL。

甘遂半夏汤处方：醋甘遂1 g/kg(研末)，炙甘草15 g/kg，法半夏0.9 g/kg，白芍1.5 g/kg, 蜂蜜1.5 g/kg。(此剂量为课题前期结果，醋甘遂与炙甘草按照1∶15比例配伍时，具有一定的肝损伤)

甘遂半夏汤全方药液的制备：将炙甘草、法半夏、白芍加入10倍量水浸泡1小时，大火煮沸后小火煎煮1小时，将药液倒出。再加入8倍量水煎煮，大火沸腾后小火煎煮1小时。将两次煎煮的药液合并，加入蜂蜜，放置于水浴锅上浓缩至1.89 g/mL，临用时按比例加入醋甘遂粉末，加水至1.99 g/mL。

甘遂半夏汤去炙甘草药液的制备：将法半夏、白芍按照全方的煎煮方法浓缩至0.78 g/mL，临用时按比例加入醋甘遂粉末，加水至0.49 g/mL。

甘遂半夏汤去醋甘遂药液的制备：将炙甘草、法半夏、白芍按照全方的煎煮方法浓缩至1.89 g/mL。

甘遂半夏汤去炙甘草醋甘遂药液的制备：将法半夏、白芍按照全方的煎煮方法浓缩至0.39 g/mL。

1.4试剂

PCR实验试剂：DEPC处理水(北京索来宝科技有限公司， 生产批号：20140822)；Trizol RNA提取试剂(美国Invitrogen公司，生产批号：66014)；Gold View核酸染料(北京索来宝科技有限公司，生产批号：20140510)；RNA逆转录试剂盒[赛默飞世尔科技(中国)有限公司，生产批号：00169216]；OligdT[生工生物工程(上海)股份有限公司，生产批号：109302I]；2×tag mix(北京索来宝科技有限公司，生产批号：20140901)；Marker I DNA Ladder(北京索来宝科技有限公司，生产批号：20140402)；6×DNAloading Buffer(北京索来宝科技有限公司, D1010)；5×TBE(北京索来宝科技有限公司，生产批号：20141021)；Agarose 琼脂糖(伯齐科技有限公司，生产批号：111860)；三氯甲烷(北京化工厂，生产批号：20140312)；异丙醇(北京化工厂，生产批号：20140417)；无水乙醇(北京化工厂，生产批号：20140409)。

肾脏凋亡检测试剂：1MTris-Hcl缓冲液(Ph=7.5)(北京索来宝科技有限公司，生产批号：20140403)；蛋白酶K(北京中山金桥生物技术有限公司，生产批号：14374846)；3%双氧水(北京中山金桥生物技术有限公司，生产批号：131023)；二甲苯(北京益利精细化学品有限公司，生产批号：1208122)。

1.5造模与给药方法

将冻存于-70℃冰箱中的Walker-256细胞于37℃水浴中复苏，分为0.5 mL、0.8 mL、1 mL的不同剂量注入大鼠体内，大鼠长出腹水后抽取其腹水以每只1 mL的剂量注入健康大鼠体内进行二次传代，二次传代的大鼠长出腹水后，选取黄色澄清腹水进行细胞计数，生理盐水稀释至1.68×106个细胞/mL，注入正式实验的大鼠体内，每只注射1 mL。1.6分组

将大鼠按体质量进行随机分组，组别为空白组、模型组、阳性对照组、甘遂半夏汤全方给药一次组(简称全方一次组)、甘遂半夏汤全方去炙甘草给药一次组(简称去草一次组)、甘遂半夏汤全方去醋甘遂给药一次组(简称去遂一次组)、甘遂半夏汤全方去炙甘草醋甘遂给药一次组(简称去草遂一次组)、甘遂半夏汤全方给药二次组(简称全方二次组)、甘遂半夏汤全方去炙甘草给药二次组(简称去草二次组)、甘遂半夏汤全方去醋甘遂给药二次组(简称去遂二次组)、甘遂半夏汤全方去炙甘草醋甘遂给药二次组(简称去草遂二次组)，共计11组。

每组20只大鼠，各组于造模后第二天开始灌胃。空白组、模型组分别1 mL/100 g每天一次给予生理盐水灌胃。给药一次组及阳性药组按1 mL/100 g每天一次灌胃，给药二次组上午下午按照每次0.5 mL/100 g每天两次灌胃。1.7样本取材与指标检测

给药14天取材。所有大鼠在取材前一天晚上8点禁食不禁水，禁食12小时，次日取材前1小时灌胃一次，之后10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，迅速取出一侧肾脏，选取同一部位肾组织约黄豆大小一块，置于冻存管中，液氮冻存。取另一侧肾脏放入10%甲醛溶液中固定，待检测相关指标。每组选取8个组织样本进行RT-PCR检测，选取3个组织样本进行肾脏免疫组化调亡检测。1.7.1肾脏AQP-2 mRNA指标检测RT-PCR法对肾脏AQP-2 mRNA表达进行检测。

(1)PCR引物合成:AQP引物由生工生物工程(上海)股份有限公司提供，具体碱基序列如表1所示。

(2)cDNA扩增:取各组RT反应产物配制PCR

表1　PCR引物信息

扩增反应液，成分组成如下：GAPDH Forward Primer 0.25 μL，GAPDH Reverse Primer 0.25 μL，AQP-2 Forward Primer 0.4 μL，AQP-2 Reverse Primer 0.4 μL，2x tag mix 10 μL，CDNA 2 μL，dH2O 6.7μL。

反应条件：

Stage 1:预变性——94℃: 3分钟

Stage 2:PCR反应——(Reps: 32)94℃:30秒→59℃:30秒→72℃:1分钟→72℃延伸8分钟

(3)数据采集:1.2% 琼脂糖凝胶电泳。以GAPDH作为内标，计算公式如下：RNA含量=目的基因/GAPDH

1.7.2肾脏免疫组化凋亡检测Tunnel法检测肾脏细胞凋亡，操作按说明。光镜拍照，Image-Pro Plus 6.0软件进行细胞计数。

1.8统计学处理

2结果

2.1不同给药次数条件下的甘遂半夏汤加减甘遂甘草反药组合对腹水大鼠肾脏AQP-2 mRNA表达的影响

与空白组比较，模型组、阳性药组、去草一次组、去遂一次组、去遂二次组、去草遂一次组、去草遂二次组肾脏AQP-2 mRNA表达量升高，具有统计学差异(P<0.01)；而与模型组比较，全方一次组、去草一次组表达量降低，具有统计学差异(P<0.01或P<0.05)，全方二次组表达量具有降低趋势，但不具有统计学差异(P>0.05)；与全方一次组比较，去遂一次组、去草遂一次组表达量升高，具有统计学差异(P<0.05)；与全方二次组比较，去草二次组、去遂二次组、去草遂二次组表达量具有升高趋势，但不具有统计学差异(P>0.05)。见表2，图1。

表2　各组大鼠AQP-2 mRNA表达的结果

注： 每组选取8个样本进行RT-PCR检测。在后期数据分析中，空白组及模型组不符合正态分布，每组分别有两个数据被剔除。

图1　各组大鼠肾脏AQP-2 mRNA电泳结果

2.2不同给药次数条件下的甘遂半夏汤加减甘遂甘草反药组合对腹水大鼠肾组织凋亡的影响

与空白组相比较，模型组、阳性药组、去草一次组、去遂一次组、去草遂一次组、去草遂二次组大鼠肾组织凋亡增加，具有统计学差异(P<0.01)；其余各给药组凋亡具有增加趋势，但不具有统计学差异(P>0.05)。与模型组比较，阳性药组、全方一次组、去遂一次组、去草遂一次组、全方二次组、去草遂二次组凋亡减轻，具有统计学差异(P<0.01或P<0.05)。与全方一次组比较，去遂一次组、去草遂一次组凋亡增加，具有统计学差异(P<0.01)；去草一次组凋亡具有增加趋势，但不具有统计学差异(P>0.05)。与全方二次组比较，去草遂二次组凋亡增加，具有统计学差异(P<0.01)；去草二次组凋亡具有增加趋势，但不具有统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3　大鼠肾组织凋亡的结果±s)

3讨论

以往对于“十八反”的探讨多在生理状态下集中在单纯的反药药对上，而本实验以含有反药组合的复方为基础，在特定病理模型的基础上进行研究。甘遂半夏汤为治疗腹水的经典名方，本实验选取与甘遂半夏汤逐水作用密切相关的肾脏指标AQP-2基因表达及肾脏细胞凋亡为研究对象，从一定程度上反映出甘遂甘草反药组合对甘遂半夏汤治疗腹水作用的影响。

水通道蛋白(aquaporin, AQP)，又称水蛋白，它是一组与水通透相关的细胞膜转运蛋白。其中AQP-2是加压素依赖性水通道蛋白,主要位于肾集合管主细胞管腔侧及其附近的囊泡内，用以调节肾脏集合管对水通透性，在调节肾脏水平衡中起到了重要作用[5]。它可使水液的重吸收增加，尿量减少，尿液浓缩。研究表明，AQP-2数量受抗利尿激素的调节，当激素水平降低时,主细胞管腔膜出现胞吞作用，形成含AQP-2的囊泡迁移到管腔膜下的胞浆内，导致AQP-2数量相应地减少[6]。另有临床报道，肝硬化腹水患者尿液AQP-2含量明显高于无腹水患者[7]。本实验结果显示，与空白组比较，模型组及多个给药组AQP-2 mRNA表达升高，提示walker-256恶性腹水模型可能影响AQP-2 mRNA表达，使肾集合管对水重吸收增强，尿量减少，导致腹水的进一步发展，此结果与临床报道中AQP-2变化趋势一致。与模型组比较，全方一次组和全方二次组AQP-2 mRNA表达降低，提示甘遂半夏汤可以抑制集合管对水的重吸收，增加尿量，从而减缓恶性腹水的进一步发展，但给药次数对这种减缓作用无影响，且全方组的作用优于全方去掉一味或两味反药组。

细胞凋亡是机体为维持内环境稳定，细胞自主有序的死亡，此过程是由基因控制的。细胞凋亡与被动的细胞坏死不同，它是一个主动过程，并涉及基因的激活、表达以及调控等一系列作用。它是机体为了更好地适应环境而主动争取的一种死亡过程[8]。本实验结果显示，与空白组比较，模型组及各个给药组平均光密度值升高，说明walker-256癌性腹水模型对大鼠肾组织造成了损伤。与模型组比较，全方一次组和全方二次组平均光密度值降低，说明甘遂半夏汤具有减缓癌性腹水造成的肾组织细胞过度凋亡的作用。但给药次数未对这种减缓作用造成影响，且全方的作用优于全方去掉一味或两味反药组。

参考文献

[1]范永升.金匮要略[M].北京:中国中医药出版社,2007:160.

[2]赵桐,钟赣生,张建美,等.含甘遂-甘草反药组合的甘遂半夏汤临床用药分析[J].中国临床医生杂志,2014,(12):89-91.

[3]张建美,许皖,钟赣生,等.甘遂甘草反药组合宜忌条件的实验研究回顾与评价[J].环球中医药,2015,8(9):25-30.

[4]张建美,许皖,钟赣生,等.大戟甘草反药组合宜忌条件的实验研究回顾与评价[J].环球中医药,2015,8(9):38-42.

[5]唐庆娟.水通道蛋白家族成员AQP2的研究进展[J].国外医学(生理、病理科学与临床分册),2001,21(3):238-240.

[6]刘彦华,才丽平.肾脏AQP2表达及穿梭调节的分子机制[J].国外医学(生理、病理科学与临床分册),2004,24(5):463-466.

[7]王建华.肝硬化腹水患者血浆AVP和尿AQP2的检测及临床意义[J].临床合理用药杂志,2013,6(17):155.

[8]李超,伏圣博,刘华玲,等.细胞凋亡研究进展[J].世界科技研究与发展,2007,29(3):45-53.

(本文编辑： 蒲晓田)

Comparing the effect ofGansuiBanxiadecoction plus or reduce kansui and glycyrrhiza on AQP-2 mRNA expression and apoptosis rate of kidney tissue in ascites rats under different times

ZHANGJian-mei，XUWan，ZHONGGan-sheng，etal.

SchoolofBasicMedicalSciences,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China

【Abstract】ObjectiveTo find out the effect of Gansui Banxia decoction plus or reduce kansui and glycyrrhiza under different times of administration on AQP-2 mRNA expression and apoptosis rate of kidney tissue in malignant ascites rats. MethodsWalker-256 cells were used to induce the malignant ascites rat model. The Wistar rats were randomly divided into blank group, model group, furosemide group, once or twice of Gansui Banxia decoction group, once or twice of Gansui Banxia decoction removed glycyrrhiza group, once or twice of Gansui Banxia decoction removed kansui group, once or twice of Gansui Banxia decoction removed glycyrrhiza and kansui group. Once group was gavaged at morning, and twice group was gavaged at morning and afternoon, which total dose was as much as the once group. After 14 days’ feed, kidney was collected and kep in liquid nitrogen and then RT-PCR and immunohistochemistry experiments was conducted. ResultsThe result of AQP-2 mRNA expression and apoptosis rate of kidney tissue showed no difference in once and twice Gansui Banxia decoction group, but showed a decreasing tendency compared to the groups removed one or two imcompatible pairs. ConclusionDiuresis of Gansui Banxia decoction is better than it removed one or two imcompatible pairs. Gansui Banxia decoction can reduce the excessive apoptosis of kidney tissue and the effect of whole prescriptionis is better than it removed one or two imcompatible pairs.

【Keywords】Kansui；Glycyrrhiza；Anti herb combination；Aquaporin-2 mRNA；Apoptosis of kidney tissue

(收稿日期：2016-01-05)

Corresponding author:ZHONG Gan-sheng, E-mail： zhonggansheng@sohu.com

【中图分类号】R285.5

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.05.005

作者简介：张建美(1986- )，女，2013级在读硕士研究生。研究方向：中药药性理论研究。E-mail：kkmm20110814@163.com通讯作者： 钟赣生(1961- )，硕士，教授，博士生导师。研究方向：中药药性理论研究。 E-mail：zhonggansheng@sohu.com

基金项目：国家重点基础研究发展计划(973计划) (2011CB505306)；北京中医药大学2015年度基本科研业务费项目(在读研究生项目)(2015-JYB-XS033)