豆酱中产细菌素屎肠球菌的筛选及特性分析

王晓蕊，邹婷婷，郭志富，张春红，陶冬冰 ，王寅刚，乌日娜,2*

1(沈阳农业大学 食品学院，辽宁 沈阳，110866) 2(江南大学 食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡，214122) 3(沈阳农业大学 生物技术学院，辽宁 沈阳，110866)



豆酱中产细菌素屎肠球菌的筛选及特性分析

王晓蕊1，邹婷婷1，郭志富3，张春红1，陶冬冰1，王寅刚3，乌日娜1,2*

1(沈阳农业大学 食品学院，辽宁 沈阳，110866) 2(江南大学 食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡，214122) 3(沈阳农业大学 生物技术学院，辽宁 沈阳，110866)

摘要从农家传统发酵豆酱中分离出164株疑似乳酸菌，其中有84株球菌。试验筛选到1株产细菌素的屎肠球菌R1并对其理化性质进行研究。该细菌素对金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌等具有较好的抑制作用，对酸和热稳定。经鉴定该细菌素种类为肠球菌素P。菌株R1在pH3.0模拟胃液中3 h存活率达86.35%，在模拟肠液中6 h存活率达87.72%，对人工消化液耐受性良好。药敏试验结果表明，菌株R1对青霉素、氨苄西林、环丙沙星、氯霉素和庆大霉素敏感，对诺氟沙星和红霉素不敏感，未检测出毒力因子，具有潜在安全性。

关键词屎肠球菌；细菌素；豆酱；特性

乳酸菌细菌素，是由乳酸菌通过核糖体合成机制产生的一类具有抗菌活性的蛋白质类物质[1]，可作为天然防腐剂，对病原菌和腐败菌的生长繁殖具有抑制作用[2]。乳酸菌本身对其产生的细菌素具有免疫性[3]。细菌素具有安全、无毒，可被人体降解等诸多优点，因此在开发天然防腐剂领域引起广泛关注[4]。

屎肠球菌(Enterococcusfaecium)是乳酸菌的一种，能够产生细菌素的屎肠球菌广泛存在于大豆发酵制品中[5]。该菌对于高温、高盐、酸碱和氧气具有较好抗逆性，也具有较好的免疫性和肠道黏附能力[6-7]，在高温和低pH值条件下的稳定性对提高细菌素的产量有着积极的作用[8]。屎肠球菌产生的类细菌素具有分子质量小、热稳定性强等特点，具有良好的应用前景[9]。

传统发酵豆酱中微生物种类繁多，并含有异黄酮类、多酚类、大豆皂苷、类黑精等多种对人体有益的生理活性物质，具有很好的保健功能[10]。本研究以金黄色葡萄球菌为指示菌，从农家传统发酵豆酱中筛选出产细菌素的屎肠球菌，并对细菌素相关性质进行分析，希望用天然细菌素代替传统抗生素，为天然食品防腐剂和饲料添加剂的开发应用提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1分离材料

辽宁省(沈阳、康平、锦州、营口、抚顺和丹东)传统农家发酵豆酱。

1.1.2主要试剂及培养基

胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K，上海福芮生物科技有限公司；牛胆盐，上海研生实业有限公司；药敏纸片，杭州长城机电市场；LB培养基、MRS培养基。

1.1.3指示菌

金黄色葡萄球菌(StaphylococcusaureusAS1.2465)、大肠杆菌O157:H7(EscherichiacoliO157:H7 882364)、单核细胞增生李斯特菌(ListeriamonocytogenesC53-3)、弗氏志贺氏菌(ShigellaflexneriCMCC51592)和鼠伤寒沙门氏菌(SalmonellatyphimuriumS50333)由内蒙古农业大学保存；植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)和地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)由本实验室分离得到。

1.2仪器与设备

LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌锅,上海申安医疗器械厂；生物洁净工作台,苏州市华宇净化设备有限公司；DNP-9080型生化培养箱,上海精宏试验仪器有限公司；牛津杯,上海江星仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1乳酸菌的分离与纯化

采用常规平板稀释法[11]和平板划线分离法[12]对豆酱中乳酸菌进行分离纯化，之后进行革兰氏染色和过氧化氢酶试验。

1.3.2产细菌素乳酸菌的初筛

采用牛津杯法[13]，将乳酸菌发酵液于10 000 r/min离心10 min取上清液备用。调指示菌浓度为107CFU/mL，取100 μL均匀涂布在LB固体培养基上，4 ℃静置1 h后，等距放置3个牛津杯，分别加入100 μL无菌发酵上清液，37 ℃培养18～24 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径。

1.3.3产细菌素乳酸菌的复筛

1.3.3.1有机酸的排除[2]

乳酸菌发酵上清液用1 mol/L的NaOH或HCl溶液调节pH至5.0，同时测定pH5.0的乙酸和乳酸的抑菌活性，重复3次取均值。

1.3.3.2过氧化氢的排除[14]

将乳酸菌发酵上清液于80 ℃水浴加热10 min，测抑菌活性，重复3次取均值。

1.3.3.3蛋白酶类抑菌物质的确定[1]

将胰蛋白酶溶解到50 mmol/L的磷酸缓冲液(pH7.6)中，再加入到乳酸菌发酵上清液，使其终浓度为1 mg/mL，调节pH至7.6，37 ℃水浴1 h后，调回初始pH，检测抑菌活性，重复3次取均值。

1.3.4产细菌素乳酸菌菌株的鉴定

1.3.4.1生理生化鉴定

根据相关文献[15、16]对菌株进行生理生化鉴定。

1.3.4.216S rRNA基因序列同源性分析鉴定

优化的CTAB法提取菌株DNA[17]。采用通用引物[18]进行PCR扩增，将片段长度约为1 500 bp的阳性产物送至上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。在NCBI上使用BLAST进行同源性比对，并用MEGA软件包以neighbour-joining (NJ)法构建系统发育树[19]。

1.3.5抑菌谱的测定

选取单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌、地衣芽孢杆菌等多种菌株作为指示菌，采用牛津杯法测定产细菌素乳酸菌的抑菌谱。

1.3.6细菌素稳定性研究[20]

1.3.6.1细菌素的酸碱稳定性

用1 mol/L的NaOH或HCl溶液调节乳酸菌发酵上清液pH至2～10，37 ℃保温2 h后，测抑菌活性，重复3次取均值。

1.3.6.2细菌素的热稳定性

用1 mol/L的NaOH溶液将乳酸菌发酵上清液pH调至5.0，分别在60、80、100 ℃处理30 min，121 ℃处理15 min，以相同pH值的未经加热处理的发酵上清液作为空白对照，检测抑菌活性，重复3次取均值。

1.3.6.3细菌素对蛋白酶的敏感性

方法同“1.3.3.3”所述，采用胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶k。

1.3.7细菌素种类的确定

1.3.7.1肠球菌素基因PCR检测

参考文献按[20-21]设计引物，引物由天根生化科技有限公司合成(表1)。以基因组DNA为模板扩增细菌素基因序列，所得PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测[22]。[27]合成肠球菌毒力基因相关引物，见表2。以基因组DNA为模板，对目的毒力因子基因进行PCR扩增，所得PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

表1　菌株R1细菌素相关基因PCR扩增引物

1.3.7.2细菌素基因片段的克隆

采用胶回收试剂盒(Sangon Biotech SK8132)对PCR产物进行纯化回收，按载体说明，将纯化后的PCR产物与pEASY-T1载体相连接，连接产物于-20 ℃保存。向50 μL大肠杆菌感受态细胞中加入5 μL连接产物，混匀，冰浴静置30 min。于42 ℃水浴60～90 s，迅速放于冰上5 min。加入500 μL LB液体培养基，混匀，于37 ℃，150 r/m摇床培养1 h。取150 μL菌体均匀涂布于含有氨苄的LB固体平板，37 ℃培养12～16 h。挑取平板上的白斑接种于10 μL RNase-Free Water中，混匀，以该混合物为模板进行PCR检测，将有条带的样品转移到10 mL含有氨苄的LB液体培养基中，37 ℃，150 r/m摇床培养12～16 h。将培养好的新鲜菌液送至上海桑尼生物科技有限公司进行测序。

1.3.8产细菌素菌株的益生性

1.3.8.1模拟胃液耐受性

参照国家药典[23]配制模拟胃液，取活化好的菌液于6 000 r/min离心2 min，向菌体中加入与培养基等量的模拟胃液，37 ℃培养3 h，采用倾注培养法对0、3 h的培养液进行活菌计数[24]，计算存活率。

1.3.8.2模拟肠液耐受性

参照国家药典[23]配制模拟肠液，取活化好的菌液于6 000 r/min离心2 min，向菌体中加入与培养基等量的模拟肠液，37 ℃培养6 h，采用倾注培养法对0、2、4、6 h的培养液进行活菌计数，计算存活率。

1.3.8.3胆盐耐受性

将菌株发酵液以3%接种量接种到含有0.3%胆盐浓度的MRS液体培养基中，37 ℃培养6 h后，采用倾注培养法对0、2、4、6 h的培养液进行活菌计数，计算存活率。

1.3.9产细菌素菌株的安全性

1.3.9.1菌株的耐药性

采用药敏纸片法[6,25]测定菌株耐药性，参照纸片法抗菌药物敏感试验标准进行判定[26]，重复3次取均值。

1.3.9.2毒力基因检测

2结果与分析

2.1乳酸菌的分离

从辽宁省6个地区的13份豆酱样品中，共分离出164株革兰氏染色为阳性，过氧化氢酶试验为阴性的疑似乳酸菌菌株，包括84株球菌。

表2　毒力因子基因PCR扩增引物

2.2产细菌素乳酸菌的筛选

从84株球状疑似乳酸菌中，初筛得到24株具有较好抑菌特性的菌株，再进行复筛。

酸排除试验后，菌株FSI-4、FSI-3和R1的抑菌性分别下降27.45%、19.83%和12.26%；H2O2排除试验后，抑菌性分别下降16.26%、3.79%和2.59%，鉴于菌株R1受酸和H2O2的影响最小，且其抑菌活性相对于其他菌种最好，所以后续试验均采用R1为目的菌株。具体结果见表3和图1。

表3　产细菌素乳酸菌复筛结果

注：“-”没有抑菌效果，包含牛津杯直径为8 mm。

R1的发酵上清液用胰蛋白酶处理后不产生抑菌圈，抑菌活性下降100%。可以推测该抑菌物质对蛋白酶敏感，属于蛋白质类物质，可初步确定为细菌素。

2.3产细菌素菌株的鉴定

2.3.1生理生化试验

如表4，根据菌株形态特征并参照《伯杰细菌鉴定手册(第八版)》[15]和《常见细菌系统鉴定手册》[16]，菌株R1属于肠球菌属(Enterococcussp.)。

A-发酵上清原液抑菌情况；B-pH5.0的发酵上清液抑菌情况；C-排除H2O2后抑菌情况；D-胰蛋白酶处理后抑菌情况图1　菌株R1的复筛结果Fig.1　Further screening of bacteriocin producing R1

试验项目葡萄糖阿拉伯糖乳糖蔗糖半乳糖麦芽糖甘露糖山梨醇果糖淀粉水解明胶液化纤维二糖柠檬酸盐丙酮酸盐0.02%叠化钠0.04%碲酸盐过氧化氢酶40%胆盐精氨酸双水解酶10℃和45℃6.5%NaClpH9.6结果+++++++﹣+﹣﹣+﹣﹣+﹣﹣+++++

注：“+”阳性；“-”阴性。

2.3.216S rDNA 序列同源性分析鉴定

电泳图显示，在约1 500 bp处出现荧光条带，扩增成功。将测序结果在NCBI上进行BLAST比对，确定该菌株为屎肠球菌(Enterococcusfaeciums)。系统发育树如图2。

图2　R1的16S rDNA基因序列系统发育树Fig.2　Phylogenetic tree of strain R1 based on 16S rDNA gene sequence

2.4抑菌谱的测定

如表5所示，R1所产细菌素对多数指示菌有一定程度的抑制作用，尤其是对单核细胞增生李斯特菌显示出较强的抑制能力，抑菌范围较广。

表5　细菌素的抑菌谱

注：“-”无抑菌性；“+”抑菌圈直径<10 mm；“++”抑菌圈直径10～15 mm；“+++”抑菌圈直径>15 mm。

2.5细菌素稳定性的研究

鉴于R1对李斯特菌的抑制能力最强，以下试验均选取李斯特菌为指示菌。

2.5.1细菌素酸碱稳定性

R1所产细菌素在pH 2～6时均具有抑菌活性，随pH升高抑菌活性逐渐下降，pH 7～10已无抑菌活性，可见该细菌素在酸性环境下具有较好的抑菌效果，说明酸有助于其发挥抑菌作用。见表6。

表6　细菌素的酸碱稳定性

注：“-”没有抑菌效果。

2.5.2细菌素热稳定性

细菌素残余活性随温度升高而下降，在121 ℃条件下处理15 min后，抑菌活性仍然保留78%，说明其具有一定的热稳定性。见表7。

表7　细菌素的热稳定性

2.5.3细菌素对蛋白酶的敏感性

R1所产细菌素易被胰蛋白酶和蛋白酶k降解，抑菌活性下降100%，胃蛋白酶处理后抑菌活性亦显著下降，可以确定该物质对蛋白酶敏感，确为蛋白质类物质。见表8。

表8　细菌素对蛋白酶敏感性

注：“-”没有抑菌效果。

2.6细菌素种类的确定

只有以EntP-F/R为引物的PCR产物大小与预期片段长度相同，该产物经纯化克隆后，由上海桑尼生物科技有限公司测序，将所得序列在NCBI数据库进行比对，证实菌株R1所产细菌素的种类为EntP。

2.7产细菌素菌株的益生性

由于饮食结构不同胃液pH通常在1.5～4.5之间波动，一般为3.0[24]。经3 h培养，菌株R1在pH2.5和pH3.0的模拟胃液中存活率分别达44.10%和86.35%，可见，该菌株对模拟胃液具有很好的耐受性。见表9。

表9　屎肠球菌R1对模拟胃液的耐受性

正常人体小肠中胆汁盐质量浓度在0.3～3.0 g/L之间[28]。R1在模拟肠液中培养6 h后，存活率为87.72%，在含0.3%胆盐的培养基中培养6 h后，存活率为32.21%(见表10)，可见，该菌株对模拟肠液和胆盐也有一定程度的耐受性，该菌株具有潜在的益生特性。

表10　屎肠球菌R1对模拟肠液和胆盐的耐受性

2.8产细菌素菌株的安全性

参照纸片法抗菌药物敏感试验标准，根据抗菌药物对试验菌株产生的抑菌圈大小或最小抑菌浓度(MIC)的不同，将评价标准分为敏感(Susceptible)、中介(Intermediate)和耐药(Resistant)。R1对所选抗生素均无抗性(见表11、图3)。毒力基因PCR扩增后的电泳图谱并没有和预期片段大小相同的条带出现，可初步确定R1不含这6种毒力基因，具有潜在安全性。

表11　屎肠球菌R1药敏试验结果

图3　屎肠球菌R1药敏试验结果Fig.3　Profile of antibiotics susceptibility of E.faeciums R1

3结论

本试验从传统发酵豆酱中分离得到1株产细菌素的屎肠球菌R1，所产细菌素种类为肠球菌素P。菌株R1对人工消化液具有很好的耐受性，其产生的细菌素具有热稳定性好、pH范围宽等特性，这与AHMADOVA[29]等从奶酪中分离出的屎肠球菌AQ71所产细菌素的性质相似，与之相比，R1所产细菌素对于化学试剂的稳定性值得进一步探究。

该细菌素对多种指示菌都具有较好的抑菌效果，尤其是对李斯特菌效果显著。MTIBAA[30]等对屎肠球菌所产细菌素的基因序列进行分析，证实了羟脯氨酸残基是其抑制单增李斯特菌细菌的作用方式。而从蛋白角度，GOMEZ[31]等将肠球菌素AS48作用于李斯特菌后，发现李斯特菌的多种应激蛋白和细胞代谢蛋白发生变化，这为肠球菌素AS48抑菌机理的研究提供了方向。目前，国内对于肠球菌素P研究甚少，其对李斯特菌抑制机理值得进一步探索。

此外，菌株R1对青霉素、环丙沙星等多种抗生素敏感，并且未检出毒力基因，具有潜在的安全性。

乳酸菌素作为天然的食品防腐剂和饲料添加剂具有广阔的开发应用前景。本试验筛选出的产细菌素的屎肠球菌R1，具有较好的稳定性、益生性和潜在的安全性，可作为今后开发利用的优质菌种资源。

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Characterization of bacteriocin produced byEnterococcusfaeciumisolated from soypaste

WANG Xiao-rui1, ZOU Ting-ting1, GUO Zhi-fu3, ZHANG Chun-hong1,TAO Dong-bing1, WANG Yin-gang3, WU Ri-na1,2﹡

1(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China) 2(State Key Laboratory of Food Science and Technology, College of Food Science, Jiangnan University, Wuxi 214122, China) 3(College of Biotechnology,Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

ABSTRACTTo provide strain for the development and application of natural food preservatives and feed additives, 164 suspected lactic acid bacteria strains including 84 coccus-shaped strains were isolated from naturally fermented soypaste. A strain of Enterococcus faecium R1 producing bacteriocin was selected. Its physical and chemical properties were studied. The bacteriocin had a strong inhibitory effect to Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli and other bacteria, and was not affected by high temperature and low pH. The bacteriocin was found to possess enterocin P. Results showed that the survival rate of strain R1 was 86.35% in pH3.0 simulated gastric fluid for 3 h and 87.72% in simulated intestinal fluid for 6 h. Strain R1 had good tolerance to artificially digested liquid. Strain R1 was sensitive to penicillin, ampicillin, ciprofloxacin, chloramphenicol and gentamicin, but was insensitive to norfloxacin and erythromycin. It was negative for the tested virulence factors. This revealed that strain R1 might be safe for further application.

Key wordsEnterococcus faecium; bacteriocin; soypaste; characterization

收稿日期：2015-11-25，改回日期：2016-01-05

基金项目：国家自然科学基金项目(31471713)；中国博士后科学基金项目(2014M560395)；辽宁省农业领域青年科技创新人才培养计划(2014048)；辽宁省高等学校优秀人才支持计划(LR2015059)；江苏省博士后科研资助计划(1402071C)；沈阳农业大学"天柱山英才支持计划"项目

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201604017

第一作者：硕士研究生(乌日娜副教授为通讯作者,E-mail:wrn6956@163.com)。