葡萄酒贮存过程中氨基甲酸乙酯动力学反应

邹弯，魏玉洁，王德良，薛洁*，武运*，左俊伟

1(新疆农业大学，新疆 乌鲁木齐，830052) 2(中国食品发酵工业研究院，北京，100015) 3(宁夏大学，宁夏 银川，750021)



葡萄酒贮存过程中氨基甲酸乙酯动力学反应

邹弯1，魏玉洁1，王德良2，薛洁2*，武运1*，左俊伟3

1(新疆农业大学，新疆 乌鲁木齐，830052) 2(中国食品发酵工业研究院，北京，100015) 3(宁夏大学，宁夏 银川，750021)

摘要为了更好地评价葡萄酒中氨基甲酸乙酯形成的潜在危害性，对贮存过程中氨基甲酸乙酯含量变化进行了研究，通过分析贮存温度、初始尿素和瓜氨酸含量对贮存过程中氨基甲酸乙酯含量的影响，表明在贮存过程中葡萄酒中尿素和瓜氨酸的变化符合平衡反应动力学模型，而氨基甲酸乙酯含量的变化呈现准一级动力学反应特征，基于研究结果，文章建立了预测贮存过程中氨基甲酸乙酯含量的方程。

关键词葡萄酒；氨基甲酸乙酯-；动力学反应；尿素；温度；瓜氨酸

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate,简称EC)，又称Urethane、聚脲乙烷，是烟草叶的天然成分，葡萄酒、白兰地、黄酒、白酒、面包、奶酪等发酵的食品和饮料的伴随产物[1-3]。1943 年，EC已被证实为致癌物质[4-6],具有遗传毒性，在动物实验中证据充分，它可以导致肺癌、淋巴癌等疾病[7-8]。EC也是人体可能的致癌对象。1987年,国际癌症研究机构(IARC)将EC归为2B类致癌物[9]。2002年，联合国粮农组织(FAO)将EC列为重点监测物质，并规定其含量不得超过20 μg/L[10]。2007年，国际癌症研究机构(IARC)再次对EC进行评估，认为经食物和饮料酒摄入的总量可能对人体健康造成潜在危险，并将其列为2A级别的致癌物质[11]。

葡萄酒中形成EC的前体物质有尿素、瓜氨酸、氢氰酸、N-氨基甲酰化合物等。研究表明，高温、乙醇、尿素和瓜氨酸、发酵时间等条件都对EC的形成有显著作用[12-15]。同时UTHURRY等研究也发现，刚酿造的葡萄酒中EC含量一般在1～10 μg/L，但贮存条件和时间会影响消费时葡萄酒中的EC含量；高温、高含量的乙醇、尿素和瓜氨酸都对EC的形成有显著作用，因此要确保葡萄酒贮存一定时间后EC含量仍在一个合理的水平，首先要建立能够准确预测贮存期间葡萄酒EC含量的方法。目前经典的预测潜在EC含量的方法是将葡萄酒在80 ℃下加热保持24 h，但该方法得到的EC含量数值偏大，并不能真正反映贮存期间EC实际浓度的变化趋势[16-17]，因此建立一种葡萄酒贮存期间EC浓度的预测模型具有重要意义。本研究在探讨葡萄酒EC动力学反应规律的基础上，建立了预测贮存过程中EC含量的方程，为揭示葡萄酒贮存期间EC的变化机理提供科学的理论依据。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1葡萄酒样品制备

参考付方圆等人的方法[18]。

1.1.2仪器与设备

气质联用仪，美国PerkinElmer公司，安捷伦DB-FFAP毛细管色谱柱(60 m×0.25 μm×0.25 μm)；strata FL-PR Florisil固相萃取柱，上海安谱科学仪器有限公司。

1.1.3主要化学试剂

氨基甲酸乙酯(EC)(纯度>99%)、内标物氨基甲酸丙酯(nPC)(纯度>98%)：Sigma公司，二氯甲烷、尿素：分析纯，丙酮、瓜氨酸：色谱纯，百灵威公司。

1.2分析方法

1.2.1标准溶液的配制

10 mg/L的EC工作液：配置质量浓度为1 000 mg/L的EC储备液(准确称取0.100 0 g EC于100 mL容量瓶中，甲醇定容)，吸取0.25 mL EC储备液于25 mL容量瓶中，用甲醇定容。

10 mg/L的nPC工作液：配置质量浓度为1 000 mg/L的nPC储备液(准确称取0.100 0 g nPC于100 mL容量瓶中，甲醇定容)，吸取nPC储备液0.25 mL于25 mL容量瓶中，用甲醇定容。

1.2.2样品前处理

酒样的制备：吸取nPC内标工作液0.25 mL于25ml容量瓶，用酒样定容，混匀，待用。

固相萃取柱的活化与洗脱：先取10 mL的正己烷，活化固相萃取柱，弃去流出液。再吸取0.5 mL制备好的酒样，缓慢流过柱体至干，弃去流出液。再吸取2 mL的正己烷洗柱，弃去流出液。最后用10 mL二氯甲烷洗脱，并用顶空瓶接收，至洗脱液流干。

将顶空瓶中的洗脱液放入氮吹仪，进行氮吹，氮吹至0.5 mL。转移氮吹液至进样瓶，待测。

1.2.3色谱-质谱条件

升温程序：柱初始温度60 ℃，保留5 min，以4 ℃/min升温速率至150 ℃，保留2 min，再以8 ℃/min升温速率至222 ℃，保留2 min。

进样口温度：260 ℃；传输线温度：240 ℃；载气：氦气(99.999%)；流速：1 mL/min；进样量：1 μL。不分流进样，2 min后，打开分流出口，分流流量30 mL/min 。

1.2.4样品检测

使用EC工作液分别用二氯甲烷制成0.01、0.02、0.05、0.1、0.2 mg/L的EC溶液，加入内标，使其质量浓度均为0.4 mg/L nPC。制作标准曲线。

处理好的试样，加入内标进样分析，利用标准曲线计算出试样中EC含量。

1.2.5瓜氨酸的测定方法

采用PITC柱前衍生高效液相色谱法[19]。

1.2.6尿素的测定方法

采用高效液相-荧光检测器法[20]。

1.2.7数据的处理

模型动力学参数的估计均采用origin9.0软件对动力学方程进行非线性拟合获得。

2结果与分析

2.1贮存温度对葡萄酒中尿素含量的影响

在葡萄酒贮存的过程中，酒液中的尿素会与乙醇继续反应，所以随着贮存时间的延长，尿素含量会降低。本实验将初始尿素含量为5.1 mg/L葡萄酒和初始瓜氨酸含量为5.73 mg/L葡萄酒分4份分别放入15、20、25、30 ℃的贮存温度下，跟踪200 d的贮存过程中尿素和瓜氨酸的含量的变化，结果如图1所示。

从图1可以看出，葡萄酒贮存期间，尿素含量呈对数下降变化趋势，贮存初期下降速度非常快，随着时间的延长，下降速度逐渐减缓。同样实验中其他3个初始尿素含量不同的葡萄酒尿素的变化也呈现相同的趋势，其含量与时间或含量的自然对数与时间均不呈线性关系，说明了贮存期间尿素的降解不符合一级反应动力学的特点，这与ROBERTO等的报道不同[2]，可能是因为本研究贮存温度较低，而且初始尿素含量较高的缘故。

图1　葡萄酒贮存过程中尿素含量的动力学变化Fig.1　The dynamic change of urea concentrations in wines during storage

图1显示,随着时间的延长，尿素含量是逐渐趋于平衡，因此参照HASNIP报道的平衡一级反应方程：

(1)

式中：k1为尿素降解反应的速率常数；k2为尿素再生成速率常数。

使用origin8.0软件将贮存期间尿素含量与方程1进行拟合，固定[U]0值，拟合结果如表1所示。

从表1数据可以看出，初始尿素含量不同的葡萄酒在不同贮存温度下拟合方程均达到了极显著水平(P值均小于0.01)，说明拟合方程(1)可以反应葡萄酒贮存期间尿素的变化特点。当尿素初始质量浓度为5.1 mg/L时，随着贮存温度的升高，反应速率随着增加，本实验中温度上升10 ℃，尿素反应速度增加了1.8倍。

表1　不同指标葡萄酒贮存过程中尿素反应拟合动力学方程及参数

注：K1为尿素降解速率常数；K2为尿素合成速率常数；[u]t为t时间葡萄酒中尿素含量，而[u]0为初始尿素含量。

2.2贮存温度对葡萄酒中EC含量的影响

由于尿素和瓜氨酸是合成葡萄酒中氨基甲酸乙酯的主要前体物质，因此尿素和瓜氨酸含量的变化会引起EC的变化，不同温度下随着葡萄酒中尿素和瓜氨酸含量的降低，EC含量也呈现对数增加趋势，如图2所示。

图2　贮存过程中葡萄酒中EC动力学变化趋势Fig.2　The dynamic change of EC concentrations in wines during storage

贮存期间，葡萄酒中EC的变化与尿素和瓜氨酸的含量变化相反，先呈现快速增加，随后缓慢增长的趋势，温度越高，葡萄酒中EC含量也会越高，贮存30 d的葡萄酒在30 ℃下样品中的EC含量约为15 ℃的1.5～2倍；但是由于本实验的贮存温度均在30 ℃以下，从结果看样品中的EC均未超过15 μg/L，说明了低温贮存可以限制葡萄酒中EC的增加量。

2.3葡萄酒初始尿素含量对贮存期间氨基甲酸乙酯含量的影响

根据资料报道，葡萄酒中EC含量与尿素浓度间呈正比例关系。本研究跟踪了初始尿素含量不同的葡萄酒贮存期间EC含量的变化，结果如图3所示。

由图3中EC的变化趋势可知，无论初始尿素含量的高低，葡萄酒中的EC均呈现开始快速增长，随后逐渐稳定的趋势。初始尿素含量越低，达到平衡所需要的时间越短，产生的EC含量也越低；初始尿素含量越高，贮存一段时间后EC的含量也越高。根据图2中的数据，可求不同时间内的EC变化量(d[EC]/dt)，结合图1得到的d[urea]/dt，作图得到一条直线，说明葡萄酒贮存期间EC的形成与尿素浓度的变化呈比例关系，直线的斜率即为由尿素形成的EC的速率常数Ku。同样的方法作由瓜氨酸引起EC含量的变化图，同样得到一条直线，直线的斜率为不同温度下的反应速率常数Kc值，结果表2所示。

图3　不同尿素含量的葡萄酒贮存期间EC的变化趋势图Fig.3　Formation of EC with time in wines which have various urea concentrations

表2　不同温度速率常数Ku(尿素形成EC)和Kc(瓜氨酸形成EC)

表2数据显示，30 ℃时，Ku和Kc分别为0.002 4和0.000 4，与HASNIP报道的28 ℃ Ku=0.001 2和Kc=0.000 18基本接近。由反应速率常数值可知，当葡萄酒贮存温度每升高10 ℃，由尿素产生的EC含量可增长1.5～2倍，根据Arrhenius方程，计算得到尿素转化生成EC的活化能Eu=34.037 kJ/mol，瓜氨酸转化生成EC的活化能Ec=66.019 kJ/mol。

2.4贮存温度对葡萄酒中瓜氨酸含量变化的影响

瓜氨酸也是影响葡萄酒中EC含量另一个重要因素，本实验对不同温度下葡萄酒中瓜氨酸的含量进行了跟踪分析，结果如图4所示。

从图4可以看出，贮存期间葡萄酒中瓜氨酸含量呈现下降趋势，贮存初期，下降速度很快，后期逐渐变缓，与尿素在贮存期间的变化趋势基本一致，根据平衡反应方程(1)对贮存期间瓜氨酸含量与时间进行拟合，拟合方程如表3。

图4　葡萄酒贮存过程中瓜氨酸含量的动力学变化Fig.4　The dynamic change of citrulline concentrations in wines during storage

温度/℃方程拟合相关系数(R2)K3K415[c]t=[c]0×0.02504+0.00757exp-(0.00757+0.02504)t0.00757+0.02504[]0.96890.007570.0250420[c]t=[c]0×0.02395+0.0145exp-(0.0145+0.02395)t0.0145+0.02395[]0.99060.01450.0239525[c]t=[c]0×0.02113+0.01827exp-(0.01827+0.02113)t0.01827+0.02113[]0.98490.018270.0211330[c]t=[c]0×0.01898+0.02728exp-(0.02728+0.01898)t0.02728+0.01898[]0.97310.027280.01898

注：K3为瓜氨酸降解速率常数；K4为瓜氨酸合成速率常数；[C]t为t时间葡萄酒中瓜氨酸含量，而[C]0为初始瓜氨酸含量，本实验为5.73mg/L。

由实验所测的K3可知，温度影响瓜氨酸的降解速率，温度每升高10倍，瓜氨酸的降解速率可提高1.5～2.5倍，大于温度对尿素降解速率的影响。根据不同温度下瓜氨酸的速率常数，可得到瓜氨酸降解反应活化能为59.27 kJ/mol。

通过分析不同温度下由瓜氨酸引起的EC含量的变化，发现瓜氨酸形成的EC与时间t之间也符合假一级反应的特征，通过拟合，得到不同温度下的反应速率常数，表3所示。

3讨论

试验数据表明，葡萄酒中EC的形成取决于贮存期间尿素和瓜氨酸含量的变化，假设葡萄酒中尿素和瓜氨酸是形成EC的两条主要途径，而且两个反应独立而不相互影响，加上整个贮存期间，葡萄酒中的酒精度基本保持不变，则t时刻葡萄酒中EC含量可表达为：

(2)

根据该公式，如果需要推测葡萄酒在20℃贮存100天的EC含量，则该表达式可转换为：

[EC]t=[EC]0+[EtOH](0.118[u]0+ 0.017 8[C]0)

根据研究数据本研究得到了预测葡萄酒贮存期间中EC含量的方程(2)，为了验证试验方程的准确性，本研究在分别在18 ℃和23 ℃下分别贮存了一批红葡萄酒和白葡萄酒，然后定期分析葡萄酒中的EC含量，将其与方程预测数据进行对比，结果显示分析数据和预测数据基本吻合(图5、图6所示)。如在50天的红葡萄酒18 ℃的分析数据和预测数据分别为3.82、3.75，23 ℃分析数据和预测数据分别为5.75、5.50；50天的白葡萄18 ℃的分析数据和预测数据分别3.58、3.30，在23 ℃的分析数据和预测数据分别为4.30、4.22。但是由于本研究只有1年的分析数据，所以随着贮存时间的延长，预测方程是否准确还需要进一步的验证。

图5　红葡萄酒预存期间不同温度下EC实测数据(-×-)与预测数据(-▲-)对比Fig.5　Formation of EC with time observed in red wine(-×-) and the corresponding formation predicted by equation4(-▲-) at various temperatures

图6　白葡萄酒预存期间不同温度下EC分析数据(-×-)和方程预测数据(-▲-)对比Fig.6　Formation of EC with time observed in white wine(-×-) and the corresponding formation predicted by equation4(-▲-) at various temperatures

4结果

温度上升10 ℃，尿素反应速度增加了1.8倍；在同一温度下，葡萄酒中初始尿素含量越高，反应速率也越高。葡萄酒初始尿素含量为15.1 mg/L，在15、20、25 ℃三个温度下的速率常数是尿素含量5.0 mg/L的2.3倍、2倍、1.7倍。

本实验建立了预测贮存过程中氨基甲酸乙酯含量的方程，可以推测葡萄酒在任意温度储存任意天数的EC含量。

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Ethyl carbamate production kinetics during wine storage

ZOU Wan1, WEI Yu-jie1, WANG De-liang2,XUE Jie2*, WU Yun1*, ZUO Jun-wei2

1(Department of Food Science and Pharmacy,Xinjiang Agriculture University, Urumchi 830052,China) 2(China National Research Institute of Food and Fermentation Industries, Beijing 10015, China) 3(Ningxia University, Yinchuan 750021, China)

ABSTRACTThe kinetics of EC formation during wine storage was investigated to evaluate the potential risk of ethyl carbamate (EC) formation in wine. The EC, urea and citrulline concentration at different storage temperatures were monitored. We found that temperature and initial urea content had significant effects on EC formation. The decay of urea and citrulline fit a first-order reaction approaching equilibrium. Based on these results, we constructed an equation to forecast the content of ethyl carbamate during wine storage.

Key wordswine; ethyl carbamate(EC); dynamic reaction; urea; temperature; citrulline

收稿日期：2015-11-19，改回日期：2015-12-28

基金项目：新疆自治区科技计划项目(201431113)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201604007

第一作者：硕士研究生(武运，薛洁为共同通讯作者, E-mail：764630324@qq.com;E-mail：825728388@qq.com)。