恩施州渔塘坝硒矿区天然高富硒微生物的筛选与鉴定

帅超群，向极钎，谈　弋，杨永康，殷红清，覃大吉，陈菲菲

(1.武汉大学药学院，湖北 武汉 430072；2.恩施清江生物工程有限公司，湖北 恩施 445000；3.恩施州农科院药物与园艺研究所，湖北 恩施 445000；4.恩施州硒应用技术与产品开发研究院，湖北 恩施 445000)



恩施州渔塘坝硒矿区天然高富硒微生物的筛选与鉴定

帅超群1,2,4，向极钎2,4，谈弋1，杨永康2，3，殷红清2,4，覃大吉2,3，陈菲菲2,3

(1.武汉大学药学院，湖北 武汉 430072；2.恩施清江生物工程有限公司，湖北 恩施 445000；3.恩施州农科院药物与园艺研究所，湖北 恩施 445000；4.恩施州硒应用技术与产品开发研究院，湖北 恩施 445000)

摘要：采用富集培养及平板划线法分离恩施州渔塘坝硒矿区中天然高富硒微生物。通过在基础发酵培养基中添加不同浓度亚硒酸钠，筛选出一株高富硒微生物XS-1，该菌株培养物最高硒含量可达34 782.52×10-6。通过形态学观察及ITS序列分析鉴定该菌株为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)，对硒具有极高的耐受及富集能力。

关键词：硒矿区；富硒微生物；筛选；鉴定

硒是动物生长必不可少的微量元素，是人体多种功能酶的活性中心，如谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)家族[1]、脱碘酶(ID)家族[2]等，在机体抗氧化、提高免疫力等方面发挥着重要的作用。

世界上包括中国在内的40多个国家和地区属于缺硒地区。据《地方疾病与环境因素图集》记载，我国72%地区属于低硒地区，其中30%为严重缺硒地区。

缺硒可能导致癌症、心肌梗塞等多种疾病的发生，通过膳食摄取足够的硒可起到预防相关疾病的作用[3]。大部分天然食物中的硒含量极低，远不能满足人体正常需求。现有补硒方式主要为食用富硒保健品、富硒食物等，根据硒的形态将硒源分为无机硒源和有机硒源。无机硒毒性高、吸收率低、环境污染大；有机硒毒性低、吸收率高、环境污染小[4]。因此，有机硒是今后补硒的主要方式。目前有机硒源主要为微生物，即利用传统的食用菌或者已经驯化的真菌资源，进行人工补硒诱导培养以获得具有高耐受力、强富硒力的菌株[5-7]。但目前人工培育菌株大多存在稳定性较差、富硒能力有限、生产成本较高等问题。

恩施被誉为“世界硒都”，恩施州恩施市双河乡渔塘坝是迄今为止全球唯一探明的独立硒矿床所在地。渔塘坝核心矿区矿石中硒含量均值为3 637.5×10-6，最高硒含量达6 300×10-6，为硒地壳丰度(0.05×10-6)的171 800倍。恩施硒矿床的发现，改写了“硒不能形成独立工业矿床”的学术界论断[8]。

作者对渔塘坝硒矿区中微生物进行筛选，并对其进行鉴定，以期发现天然高富硒微生物，为有机硒源微生物的开发奠定基础。

1实验

1.1材料与培养基

土壤、水体均取自渔塘坝硒矿区内。土壤取样点为硒矿坑内外，水体取样点为硒矿坑附近河沟小溪。

富集培养基：肉汤培养基、PD培养基、黄豆芽汁培养基。

分离培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、孟加拉红培养基、PDA培养基。各类培养基中亚硒酸钠浓度梯度为1 000×10-6、2 000×10-6、4 000×10-6、8 000×10-6、16 000×10-6、32 000×10-6。

种子培养基：PD培养基。

发酵培养基：PD培养基中添加亚硒酸钠，起始浓度为2 000×10-6。

1.2方法

1.2.1分离纯化

1)采集渔塘坝硒矿坑内土样6份、水样2份，坑前土样9份，矿坑下行100m出水沟水样1份，矿坑附近三角洲处水样3份、岩石样3份、水中腐殖物5份，矿坑木桥下水沟中水体附着物1份。将采集的样本预处理后进行富集培养。富集培养条件：肉汤培养基为25 ℃、100r·min-1、24h；PD培养基、黄豆芽汁培养基为25 ℃、100r·min-1、48h。

2)富集完成后，肉汤培养基中培养物采用稀释平板法接种到各个亚硒酸钠浓度梯度的牛肉膏蛋白胨琼脂平板上进行分离纯化；PD培养基中培养物采用稀释平板法接种到各个亚硒酸钠浓度梯度的PDA平板上进行分离纯化；黄豆芽汁培养基中培养物采用稀释平板法接种到各个亚硒酸钠浓度梯度的孟加拉红平板上进行分离纯化。

3)接种完毕后，将各接种平板转入培养室中于25 ℃、自然光照下培养5～7d后，观察不同平板上菌落生长状况，选取有菌落生长的最高亚硒酸钠浓度的平板培养物，对其采用平板划线法再次进行分离纯化，重复分离纯化直至菌落形态一致时，作为预发酵菌株备用。

1.2.2菌株筛选

将预发酵菌株接入种子培养基中于25 ℃、100r·min-1摇瓶培养5d，再接入2 000×10-6亚硒酸钠发酵培养基中于25 ℃、100r·min-1摇瓶培养5d，离心，取沉淀，用蒸馏水清洗3遍，50 ℃烘干，检测硒含量。选取硒含量最高的1～2种菌株作为目标菌株。

1.2.3菌种鉴定

对筛选的目标菌株进行形态学观察和ITS序列分析。

1)形态学观察

将目标菌株接种于PDA平板上，25 ℃、黑暗条件下培养7d，观察并记录菌落形态、质地和颜色等特征。在高倍显微镜下观察菌株形态。

2)ITS序列分析

采用CTAB法提取DNA，将DNA的OD260/OD280值调至1.6～1.8之间进行PCR扩增。ITS序列扩增引物为：正向ITS4，反向ITS5。50μLPCR反应体系为：ddH2O37.2μL、10×Buffer5.0μL、dNTPs3.0μL、Primer1.6μL、DNA3.0μL(30ng)、Taq酶 0.2μL。反应程序为：94 ℃ 5min；94 ℃ 45s，36 ℃ 45s，72 ℃ 45s，共35个循环；72 ℃ 5min。将PCR产物回收，送生工生物工程股份有限公司测序，测序结果提交GenBank进行比对分析。

2结果与讨论

2.1分离纯化

各样本富集培养物在32 000×10-6亚硒酸钠平板上均有菌落生成，表明矿区不同环境中均存在硒耐受微生物。不同培养基菌落生长状况如表1所示。

由表1可知，孟加拉红培养基中絮状菌落及黏稠状菌落均有生长，且与牛肉膏蛋白胨琼脂培养基和PDA培养基生长状况相近，表明含亚硒酸钠的不同培养基可能具有筛选一致性。

2.2菌株筛选

选择在最高亚硒酸钠浓度的培养基中生长状况良好的菌株进行摇瓶培养，2 000×10-6亚硒酸钠培养基中菌落形态及培养物硒含量如表2所示。

由表2可知，在32 000×10-6亚硒酸钠平板上生长情况较好的5株菌株在2 000×10-6亚硒酸钠培养基摇瓶培养中的形态差异明显，浑浊状、米粒状、蚕豆状、异型等形态均有出现；对硒的富集能力也有显著差异(图1)。对BP6-1菌株进一步测试表明，其培养物硒含量可达34 782.52×10-6。

表1

不同培养基中菌落生长状况

Tab.1

Growth status of colonies in different media

表2

2000×10-6亚硒酸钠培养基摇瓶培养中菌落形态及培养物硒含量

Tab.2

Morphology of colonies and selenium content of shake flask culture in medium containing 2000×10-6 sodium selenite

注：BP6-1、BP6-16、BP6-13、BP6-24、BP6-18为在32 000×10-6亚硒酸钠平板上生长情况较好的5株菌株。

2.3菌种鉴定

2.3.1形态学特征(图2)

菌株BP6-1在PDA平板上生长较快，25 ℃、黑暗条件下培养7 d，菌落直径达10～15 mm，正反面和边缘、中央部位的颜色均为白色，质地均匀，边缘整齐(图2a)；其显微特征为：菌株形态为球状，直径25.0～50.0 μm，无鞭毛，不能游动，多边芽殖(图2b，图2c)。

图1　不同微生物培养物中的硒含量

2.3.2ITS序列分析

经PCR扩增后菌株BP6-1的ITS序列全长602 bp(KU301793)，GenBank比对分析结果显示，该序列与异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)(GQ376076.1)的相似性为99%。

综上，菌株BP6-1可鉴定为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)，命名为XS-1。

2.4讨论

微生物对极端环境有着极强的耐受性，且往往对极端环境具有极强的改造性[9]。渔塘坝属于矿质极端环境，2008年，中国科学院地球化学研究所对渔塘坝微生物形态硒或硒化物的形成机理开展研究，证实了硒化物微体化石的细菌成因，提出微生物充当“冶炼师”的角色。本研究在分离纯化过程中发现多种耐、富硒微生物，从旁佐证了上述研究结果。

本研究发现，硒对部分微生物的摇瓶生长形态影响显著，摇瓶培养物出现畸变现象。如菌株BP6-18在种子培养基中，菌球近圆形，但在亚硒酸钠发酵培养基中则出现扁形、长条形等多种异形菌体(2-E)，甚至还有菌体聚合的现象发生。表明部分菌株对硒敏感性较大。硒对微生物的畸变作用机理有待进一步研究。

本研究分离筛选出的天然高富硒微生物XS-1属异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)，其培养物硒含量可达34 782.52×10-6。该酵母在发酵领域应用十分广泛，被誉为“生香酵母”，本研究也发现，培养液均有异香散发。该酵母的“生香”及“超富硒”能力，预示其在食品领域具有极好的市场应用前景，开发潜力巨大。

3结论

通过富集培养及平板划线法从恩施州渔塘坝硒矿区筛选出一株高富硒微生物XS-1，该菌株属异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)，培养物最高硒含量可达34 782.52×10-6，对硒具有极高的耐受和富集能力。

本研究虽筛选出天然高富硒微生物XS-1，但对其培养物中硒的形态未做深入研究，而富硒微生物中硒的形态特征对理论研究和实际应用均有重大价值；该菌株所具有的高硒富集能力，必然有其特殊的代谢转化机理，对它的深入研究同样有着较大的理论价值。对上述两个问题进行研究探索，将进一步为天然高富硒微生物的开发应用奠定坚实基础。

参考文献：

[1]ROTRUCK J T,POPE A L,GANTHER H E,et al.Selenium:Biochemical role as a component of glutathione peroxidase[J].Science,1973，179(4073):588-590.

[2]SMITH J L，GOOS S.Selenium nutriture in total parenteral nutrition patients:Intake levels[J].Acta Chir Scand Suppl,1979，494:95-97.

[3]FINLEY J W,DAVIS C D,FENG Y.Selenium from high selenium broccoli protects rats from colon cancer[J].J Nutr,2000,130(9):2384-2389.

[4]McADAM P A,LEVANDER O A.Chronic toxicity and retention of dietary selenium fed to rats as D- or L-selenomethionine，selenite，or selenate [J].Nutrition Res,1987,7(6)：601-610.

[5]邓桂春,侯松嵋,田冬梅，等.富硒蛹虫草中硒多糖的分离与分析[J].光谱学与光谱分析,2006,26(3):522-525.

[6]宋照军,王树宁,潘润淑，等.富硒乳酸菌的分离、筛选、驯化及富硒研究[J].中国酿造,2004,(11):4-6.

[7]范秀英,郭雪娜,傅秀辉，等.高生物量富硒酵母的选育及培养条件初步优化[J].生物工程学报,2003,19(6):720-724.

[8]彭祚全.微量元素硒与恩施硒资源[J].湖北社会科学,2000,(6):41-42.

[9]陈骏,连宾,王斌，等.极端环境下的微生物及其生物地球化学作用[J].地学前缘,2006,13(6):199-207.

Screening and Identification of Natural Selenium Super-Enriched Microorganisms in Enshi Yutangba′s Selenium Ore Area

SHUAI Chao-qun1,2,4,XIANG Ji-qian2,4,TAN Yi1,YANG Yong-kang2，3,YIN Hong-qing2,4,QIN Da-ji2,3,CHEN Fei-fei2,3

(1.SchoolofPharmaceuticalSciences,WuhanUniversity,Wuhan430072,China;2.EnshiQingjiangBio-EngineeringCo.,Ltd.,Enshi445000,China;3.MedicineandHorticulturalResearchInstitute,EnshiAcademyofAgriculturalSciences,Enshi445000,China;4.EnshiSeleniumInstituteofAppliedTechnologyandProductDevelopment,Enshi445000,China)

Abstract：The natural selenium super-enriched microorganisms in Enshi Yutangba′s selenium ore area were isolated by enrichment culture and streak plate methods.The selenium super-enriched microorganism XS-1 was screened by adding different concentrations of sodium selenite into the fermentation medium,and the highest selenium content in the fermentation products was 34 782.52×10-6.The microorganism XS-1 was identified to be Wickerhamomyces anomalus by morphological observation and ITS sequence analysis.This microorganism has high tolerance and enrichment capacity to selenium.

Keywords：selenium ore area；selenium enriched microorganism；screening；identification

中图分类号：TQ 920.1

文献标识码：A

文章编号：1672-5425(2016)04-0051-04

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.04.013

作者简介：帅超群(1987-)，男，湖北荆门人，初级农艺师，研究方向：功能微生物的开发与利用，E-mail：woshiscq@163.com。

收稿日期：2015-12-22

基金项目：湖北省科技支撑计划资助项目(2013BEC048)