抗耻垢分枝杆菌菌株的筛选及活性物质的初步研究

王茂淋，程万里，余　晨，张吉斌

(华中农业大学生命科学技术学院 农业微生物学国家重点实验室，湖北 武汉 430070)



抗耻垢分枝杆菌菌株的筛选及活性物质的初步研究

王茂淋，程万里，余晨，张吉斌

(华中农业大学生命科学技术学院 农业微生物学国家重点实验室，湖北 武汉 430070)

摘要：从80株深海细菌和425株植物根际细菌中分离得到2株对耻垢分枝杆菌有稳定拮抗作用的细菌，其中多粘类芽胞杆菌KM2501-1的拮抗效果最佳；对其活性物质的理化性质进行研究，发现该活性物质能被硫酸铵沉淀、耐高温、对部分蛋白酶敏感、在pH值2.0～8.0范围内和紫外环境下稳定，分子量在10～30 kDa之间，初步判断该活性物质可能是蛋白类物质；对该活性物质进行初步分离纯化，SDS-PAGE电泳结果显示，该活性物质中有蛋白存在；初步纯化的蛋白类活性物质的最小抑菌浓度在125～250 μg·mL-1之间，具有深入研究的价值。

关键词：多粘类芽胞杆菌；耻垢分枝杆菌；理化特性；最小抑菌浓度；耐高温蛋白

耻垢分枝杆菌常作为研究结核分枝杆菌的模式菌株。结核分枝杆菌引起的结核病是一种导致人类死亡的第二大类传染性疾病，严重威胁人类健康[1]。结核病缺乏相关有效的疫苗且新药开发较慢，使得结核和广泛耐药结核在我国流行，目前，我国已是耐多药结核负担最重的国家。耐多药结核是结核病防治的重大难题[2-4]，所以开发新的抗结核药物迫在眉睫。

多粘类芽胞杆菌(Paenibacillus polymyxa)是一种产芽胞的革兰氏阳性细菌。1993年，Ash等[5]将其从芽胞杆菌属中独立出来，成立类芽胞杆菌属。多粘类芽胞杆菌的代谢产物非常丰富，如抗菌物质、植物激素类、酶类以及絮凝剂等，大多为蛋白质、多糖、多肽等[6]。Rastogi等[7]发现，多粘类芽胞杆菌产生的多粘菌素E对结核分枝杆菌有很好的防治作用；Khan等[8]发现，从多粘类芽胞杆菌发酵上清液中提取的物质具有防治根结线虫的作用。但是多粘类芽胞杆菌中对分枝杆菌有抑制作用的蛋白类代谢产物还未见报道。

鉴于此，作者从80株深海细菌和425株植物根际细菌中筛选出抗耻垢分枝杆菌菌珠，研究其活性物质的理化性质，并进行初步纯化，评价其抑菌活性，拟为进一步研究奠定基础。

1实验

1.1菌种与培养基

病原指示菌：耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)MC2 155，由华中农业大学何正国教授课题组提供。

植物根际细菌：多粘类芽胞杆菌(Paenibacillus polymyxa)KM2501-1，分离自江西湖口有机复合污染地区植物毛茛根际，由华中农业大学张吉斌教授课题组分离并鉴定。

植物根际细菌培养基(KMB)：20g胰蛋白胨，1.5gK2HPO4，1.5gMgSO4·7H2O，10mL甘油，定容至1L，pH值调至7.4。

耻垢分枝杆菌液体培养基(7H9)：称取0.47g7H9肉汤基础至100mL蒸馏水中，添加0.2mL甘油和0.05mL吐温80。

耻垢分枝杆菌固体培养基(7H10)：称取3.8g7H10琼脂基础至200mL蒸馏水中，添加1mL甘油。

1.2方法

1.2.1抗耻垢分枝杆菌菌株的筛选

将深海细菌和植物根际细菌分别接种于对应的培养基中发酵48 h，离心取上清液；向2 mLOD600值为0.1左右的耻垢分枝杆菌悬液中加入0.5 mL过滤除菌的发酵上清液，于37 ℃、180 r·min-1共培养40 h，测定终止OD600值并判断抑菌活性，每个实验重复3次。以终浓度为100 μg·mL-1的异烟肼作阳性对照，加入相同体积的培养基作阴性对照。

1.2.2多粘类芽胞杆菌KM2501-1活性物质的理化特性分析

(1)温度处理

取KM2501-1发酵上清液，分别在温度为4 ℃、37 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃和100 ℃的条件下处理60 min，然后冷却至室温(25 ℃)，测试抑菌活性。

(2)酸碱处理

室温下取KM2501-1发酵上清液，用盐酸或氢氧化钠将pH值分别调至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0，温育3 h，然后用盐酸或氢氧化钠将各组样品的pH值复调到初始值5.6，测试抑菌活性。

(3)紫外线照射处理

取0.5 mL KM2501-1发酵上清液至2 mL离心管中，在距紫外灯(24 W)50 cm处分别照射处理30 min、60 min、90 min、120 min，测试抑菌活性。

(4)蛋白酶处理

分别用终浓度为1 mg·mL-1的蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶处理KM2501-1发酵上清液3 h后，将pH值全部调至6，测试抑菌活性。其中蛋白酶K处理条件为pH值8.0、37 ℃；胰蛋白酶处理条件为pH值8.0、37 ℃；胃蛋白酶处理条件为pH值4.5、37 ℃。

(5)超滤管处理

取KM2501-1发酵上清液5 mL，用100 kDa的超滤管超滤处理后分别测试截留液和滤过液的抑菌活性；然后将100 kDa的滤过液用50 kDa的超滤管超滤处理，分别测试截留液和滤过液的抑菌活性；用同样的方法依次用30 kDa、10 kDa和3 kDa的超滤管超滤处理。以原始上清液作对照，测试抑菌活性，并判断活性物质的分子量范围。

(6)硫酸铵沉淀

取KM2501-1在28 ℃、180 r·min-1发酵48 h的发酵上清液，采用梯度盐析法，分别收集0%～30%、30%～70%硫酸铵沉淀物和70%硫酸铵沉淀上清液，并以耻垢分枝杆菌为指示菌，采用牛津杯法测量抑菌圈直径。

1.2.3多粘类芽胞杆菌KM2501-1活性物质的初步分离纯化

(1)分离纯化

硫酸铵沉淀：取KM2501-1在28 ℃、180 r·min-1发酵48 h的发酵上清液，收集70%硫酸铵沉淀物，用蒸馏水复溶后透析。

高温处理：取上述70%硫酸铵沉淀物复溶透析液，于100 ℃高温处理60 min后离心，取上清液。

(2)抑菌活性和蛋白纯度的测定

按1.2.1所述的共培养法测试活性物质的抑菌活性；取分离纯化上清液进行SDS-PAGE电泳，测定活性物质的蛋白纯度。

1.2.4活性蛋白的抑菌活性分析

将得到的活性蛋白冻干，称量，分别配制成不同浓度，按1.2.1所述的共培养法测定活性蛋白的最小抑菌浓度。

2结果与讨论

2.1抗耻垢分枝杆菌菌株的筛选

对80株深海细菌和425株植物根际细菌抗耻垢分枝杆菌进行筛选，部分结果见表1。

表1

抗耻垢分枝杆菌菌株筛选的部分结果

Tab.1

Partial screening results of the bacteria

注：“-”表示发酵上清液不能抑制耻垢分枝杆菌生长；“+”表示发酵上清液能抑制耻垢分枝杆菌生长。“-”表示OD600差值>0.7；“+”表示OD600差值=0.5～0.7；“++”表示OD600差值=0.3～0.5；“+++”表示OD600差值=0.1～0.3；“++++”表示OD600差值<0.1。表4同。

由表1可知，多粘类芽胞杆菌KM2501-1和假单胞菌KY5406的发酵上清液都对耻垢分枝杆菌有较好的拮抗作用，其中多粘类芽胞杆菌KM2501-1的发酵上清液的拮抗效果最好，可用于后续进一步研究。

2.2多粘类芽胞杆菌KM2501-1活性物质的特性分析

2.2.1对温度的敏感性(图1)

图1　不同温度处理后的KM2501-1发酵上清液的抑菌效果

由图1可以看出，KM2501-1发酵上清液对温度不敏感，100 ℃处理60 min对抑菌活性有一定影响，但影响不明显。表明该活性物质较稳定，在高温下不易失活。

2.2.2对酸、碱的敏感性(图2)

图2　不同pH值处理后的KM2501-1发酵上清液的抑菌效果

由图2可以看出，KM2501-1发酵上清液的抑菌活性在pH值2.0～8.0范围内都是稳定的，但pH值达到10.0以后就没有抑菌活性了。表明该活性物质在碱性环境下不稳定。

2.2.3对紫外线照射的敏感性(图3)

图3　紫外线照射不同时间后的KM2501-1

由图3可以看出，KM2501-1发酵上清液经过120 min的紫外线照射后，其抑菌活性未受到影响。表明该活性物质在紫外环境下较稳定。

2.2.4对蛋白酶的敏感性(表2)

由表2可知，KM2501-1发酵上清液经过蛋白酶K和胰蛋白酶处理后失去抑菌活性，而经胃蛋白酶处理后仍然保持较高的抑菌活性；该活性物质对蛋白酶K和胰蛋白酶敏感，对胃蛋白酶不敏感。表明该活性物质可能是蛋白类物质。

表2

不同蛋白酶处理后的KM2501-1发酵上清液的抑菌效果

Tab.2Antibacterial effect of fermentation surpernatant of

KM2501-1 treated by different proteases

2.2.5分子量大小

梯度超滤处理KM2501-1发酵上清液，结果发现，抑菌活性物质可以通过30 kDa的超滤管，但不能通过10 kDa的超滤管，表明该抑菌活性物质的分子量为10～30 kDa。

综合以上理化特性实验结果，可以初步推断该活性物质是一个耐高温蛋白。

2.2.6硫酸铵沉淀物对耻垢分枝杆菌的抑菌活性(表3)

表3

KM2501-1发酵上清液的硫酸铵沉淀物的抑菌效果

Tab.3Antibacterial effect of ammonium sulfate precipitation

of fermentation surpernatant of KM2501-1

注：原始发酵上清液的抑菌圈直径为11.2 mm。

由表3可知，活性物质主要集中在30%～70%的硫酸铵沉淀物中。表明该活性物质可以被硫酸铵沉淀下来，可能为蛋白类物质。

2.3多粘类芽胞杆菌KM2501-1活性物质分离纯化后的抑菌活性及纯度

通过分析活性物质的理化特性，初步鉴定该活性物质为耐高温蛋白，故采用耐高温蛋白的方法对活性物质进行分离纯化，并进行抑菌活性测试。

2.3.1抑菌活性(表4)

表4

KM2501-1活性物质不同分离纯化阶段的抑菌活性

Tab.4Antibacterial activity of the active substance of

KM2501-1 at different purification stages

由表4可知，活性物质在不同分离纯化阶段均有很高的抑菌活性。表明该活性物质一直在纯化样品中。

2.3.2纯度

采用SDS-PAGE检测活性物质分离纯化后的纯度，结果见图4。

M.蛋白质标记　1.硫酸铵沉淀物复溶后沉淀　2.硫酸铵沉淀物

由图4可以看出，硫酸铵沉淀物复溶高温处理后离心上清液的SDS-PAGE图谱中有两条分子量介于18.4～25.0 kDa之间的蛋白条带(条带3)，与理化特性分析中活性物质的分子量相吻合。因此，可以推断该活性物质很有可能是这两个耐高温蛋白中的某一个或者两个。

2.4活性蛋白对耻垢分枝杆菌的抑菌活性(表5)

由表5可以看出，当初步纯化的活性物质浓度大于250 μg·mL-1时，对耻垢分枝杆菌具有较高的抑菌活性；当活性物质浓度小于125 μg·mL-1时，对耻垢分枝杆菌没有抑菌活性。说明初步纯化的活性物质的最小抑菌浓度在125～250 μg·mL-1之间，抑菌效果良好。

3结论

从80株深海细菌和425株植物根际细菌中分离得到2株对耻垢分枝杆菌有稳定拮抗作用的细菌，其中多粘类芽胞杆菌KM2501-1的拮抗效果最佳；其发酵上清液具有稳定拮抗耻垢分枝杆菌的活性。对KM2501-1发酵上清液中的活性物质的理化特性进行了研究，结果表明，该活性物质分子量在10～30 kDa之间，耐高温，在pH值为2.0～8.0时稳定，对部分蛋白酶敏感，能耐受紫外线，能被硫酸铵沉淀；据此初步判断该活性物质是一个耐高温蛋白。

对活性物质进行了初步的分离纯化，最终得到了分子量在18.4～25.0 kDa之间的蛋白。该初步纯化蛋白的最小抑菌浓度在125～250 μg·mL-1之间，抑菌效果良好。

表5不同浓度初步纯化活性物质对耻垢分枝杆菌的抑菌活性

Tab.5

Antibacterial activity of different concentrations of

注：“+”表示具有抑菌活性，“-”表示没有抑菌活性。

参考文献：

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Screening of Bacteria AgainstMycobacteriumSmegmatisand Preliminary Study on Its Active Substance

WANG Mao-lin，CHENG Wan-li，YU Chen，ZHANG Ji-bin

(StateKeyLaboratoryofAgriculturalMicrobiology,CollegeofLifeScienceandTechnology,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070,China)

Abstract：Two bacteria with stable antagonistic activity against Mycobacterium smegmatis were screened from 80 deep sea bacteria and 425 plant rhizosphere bacteria,in which Paenibacillus polymyxa KM2501-1 had the strongest antagonistic activity.The physicochemical properties of the active substance produced by KM2501-1 were studied.Results showed that,the active substance could be precipitated by ammonium sulfate,it was thermostable,sensitive to some proteases,stable in pH value range of 2.0～8.0 and UV irradiation,and its molecule weight was 10～30 kDa.So the preliminary research results showed that the active substance might be a protein.Then preliminary isolation and purification of the active substance and the SDS-PAGE results showed that there were proteins in the active substance.The minimal inhibitory concentration of the preliminary purified active substance against M.smegmatis was between 125 μg·mL-1and 250 μg·mL-1.It has potential for futher study.

Keywords：Paenibacillus polymyxa;Mycobacterium smegmatis;physicochemical property;minimal inhibitory concentration;high-temperature resistance protein

中图分类号：Q 939.9

文献标识码：A

文章编号：1672-5425(2016)04-0041-05

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.04.011

作者简介：王茂淋(1989-)，女，贵州六盘水人，硕士研究生，研究方向：微生物工程与制剂，E-mail：wmmmlll@163.com；通讯作者：张吉斌，教授，E-mail：zhangjb05@163.com。

收稿日期：2016-01-21