靶向survivin基因的小干扰RNA对食管癌细胞Eca-109 化疗敏感性的影响

牛朝霞，彭蕤蕤，陈　洁，秦紫芳，裴　瑞

牛朝霞，彭蕤蕤，陈　洁，秦紫芳摘要：目的　利用RNAi (RNA interference, RNAi) 技术抑制食管癌Eca-109细胞survivin基因表达，观察survivin基因沉默后对Eca-109细胞化疗敏感性的影响。方法　构建靶向survivin基因特定序列的小干扰RNA(small interference RNA, siRNA)真核表达载体并转染Eca-109细胞，筛选得到稳定转染的survivin干扰组细胞Eca-109 /si-survivin，同时设转染无关干扰质粒的Eca-109细胞为阴性对照组，未转染的Eca-109细胞为空白对照组；通过Western Blot法检测干扰前后survivin基因沉默抑制效果；随后将各组细胞与不同浓度的氟尿嘧啶(5-Fu)作用，MTT法检测各组细胞对5-Fu的半数抑制浓度(IC50)，流式细胞仪分析各组细胞的凋亡率。结果　干扰组Eca-109 /si-survivin细胞survivin蛋白表达水平(18.75±3.12)较阴性对照组Eca-109 /si-control(44.17±3.15)及空白对照组Eca-109 (46.20±2.62)明显下调(P<0.05)；联合应用5-Fu的Eca-109 /si-survivin干扰组细胞IC50为(18.75±1.53)mg·L-1，显著低于空白对照组(39.65±1.75)mg·L-1和阴性对照组(38.95±1.34)mg·L-1，差异具有统计学意义(P<0.05)；联合应用5-Fu的Eca-109 /si-survivin干扰组细胞凋亡率为(37.35±1.52)%，明显高于空白对照组(11.26±1.21)%和阴性对照组(12.34±1.32)%，差异具有显著性(P<0. 05)。 结论　靶向survivin的siRNA能特异性沉默survivin基因表达，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，并增强人食管癌Eca-109细胞对5-Fu的化疗敏感性。



靶向survivin基因的小干扰RNA对食管癌细胞Eca-109 化疗敏感性的影响

牛朝霞，彭蕤蕤，陈洁，秦紫芳，裴瑞

牛朝霞，彭蕤蕤，陈洁，秦紫芳摘要：目的利用RNAi (RNA interference, RNAi) 技术抑制食管癌Eca-109细胞survivin基因表达，观察survivin基因沉默后对Eca-109细胞化疗敏感性的影响。方法构建靶向survivin基因特定序列的小干扰RNA(small interference RNA, siRNA)真核表达载体并转染Eca-109细胞，筛选得到稳定转染的survivin干扰组细胞Eca-109 /si-survivin，同时设转染无关干扰质粒的Eca-109细胞为阴性对照组，未转染的Eca-109细胞为空白对照组；通过Western Blot法检测干扰前后survivin基因沉默抑制效果；随后将各组细胞与不同浓度的氟尿嘧啶(5-Fu)作用，MTT法检测各组细胞对5-Fu的半数抑制浓度(IC50)，流式细胞仪分析各组细胞的凋亡率。结果干扰组Eca-109 /si-survivin细胞survivin蛋白表达水平(18.75±3.12)较阴性对照组Eca-109 /si-control(44.17±3.15)及空白对照组Eca-109 (46.20±2.62)明显下调(P<0.05)；联合应用5-Fu的Eca-109 /si-survivin干扰组细胞IC50为(18.75±1.53)mg·L-1，显著低于空白对照组(39.65±1.75)mg·L-1和阴性对照组(38.95±1.34)mg·L-1，差异具有统计学意义(P<0.05)；联合应用5-Fu的Eca-109 /si-survivin干扰组细胞凋亡率为(37.35±1.52)%，明显高于空白对照组(11.26±1.21)%和阴性对照组(12.34±1.32)%，差异具有显著性(P<0. 05)。 结论靶向survivin的siRNA能特异性沉默survivin基因表达，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，并增强人食管癌Eca-109细胞对5-Fu的化疗敏感性。

关键词：小干扰RNA；survivin基因；Eca-109细胞；化疗敏感性

食管癌作为消化系统常见的一种恶性肿瘤，其发病率与病死率在我国呈逐年上升趋势，是导致中国民众乃至全世界人群恶性肿瘤死亡的重要因素之一[1-2]。目前临床绝大多数中晚期食管癌患者主要采取手术辅以放化疗的综合治疗手段，大大提高了患者术后5年生存率，改善了预后[3-5]。由此如何有效提高肿瘤对化疗药物的敏感性就成为当前食管癌研究的一个新方向。survivin作为近年来新研究发现的凋亡抑制基因，在包括食管癌在内的人类多数肿瘤组织中呈特异性高表达，而在正常分化的成人组织中表达较低甚至不表达[6]，与肿瘤生长增殖、肿瘤血管生成、肿瘤细胞放化疗敏感性等密切相关[7]，已成为当前恶性肿瘤靶向基因治疗的热点基因之一。因此，survivin基因有望成为食管癌患者基因治疗的潜在新靶点。本研究利用RNAi技术特异性沉默survivin基因，探讨其对食管癌Eca-109细胞化疗敏感性的影响，以期为临床食管癌患者靶向基因治疗提供可行性依据。

1材料

1.1主要试剂胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶和RPMI1640细胞培养基均购自美国Gibco公司；脂质体LipofectamineTM2000转染试剂盒购自美国Invitrogen公司；载体构建相关试剂BamH1/HandⅢ限制性核酸内切酶和T4 DNA连接酶均购自大连宝生物有限公司(TaKaRa公司)；质粒抽提试剂盒购自上海华舜生物工程公司；蛋白水平检测相关试剂BCA蛋白浓度检测试剂盒、ECL化学发光检测试剂盒大多购自美国Pierce公司；蛋白质分子量标准购自美国Promega公司；Survivin和β-actin检测相关抗体购自美国Santa Cruz公司；阳性干扰载体pRNAT-U6.1/Neo、阴性对照干扰载体购自美国Gencript公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)均购自Sigma公司；细胞凋亡检测采用Annexin V-FITC试剂盒，购自美国BD公司。

1.2药品氟尿嘧啶(5-Fu，每支250 mg,批号:1236) 为天津金耀氨基酸有限公司产品。

1.3细胞株人食管癌Eca-109细胞购自上海细胞生物研究所，常规培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，置于含5%CO2、温度37℃的培养箱内，待细胞生长融合度达70%～80%时，常规以2.5 g·L-1胰蛋白酶消化液进行消化与传代。

2方法

2.1靶向survivin的寡核苷酸序列的设计利用生物信息学预测软件，本实验针对survivin基因487～505 bp的靶点设计两条互补DNA链，其序列分别为：5＇-GATCCAGAATTTGAGGAAACTGCGCTGTGAAGCCACAGATGGGCGCAGTTTCCTCAAATTC-TTTTTTA-3＇和3＇-GTCTTAAACTCCTTTGACGCGACACTTCGGTGTCTACCCGCGTCAAAGGAGTTTAAG-AAAAAATTCGA-5＇，两条DNA链的结构均为：BamH1酶切点+正义序列+茎环序列+反义序列+转录终止子+HindⅢ酶切点，在细胞内形成所谓的“发夹结构”。

2.2真核表达干扰质粒的构建载体pRNAT-U6.1/Neo经HindⅢ和BamH1双酶切后与已合成的靶向survivin的寡核苷酸链退火后连接，即得到针对survivin的siRNA真核表达干扰质粒：pRNAT-siRNA-survivin，同法构建阴性对照质粒：pRNAT-siRNA-control。

2.3细胞稳定转染待Eca-109细胞达对数生长期即细胞生长融合度达90%左右时，按转染试剂盒说明将质粒pRNAT-siRNA-survivin和pRNAT-siRNA-control分别转染Eca-109细胞，待48 h后用G418进行抗性筛选2～3周，可得到稳定的细胞克隆，扩大培养，即为稳定转染细胞系，分别命名为：Eca-109 /si-survivin干扰组和Eca-109 /si-control阴性对照组，同时设置未转染的Eca-109为空白对照组细胞。。

2.4Western blot检测survivin基因沉默效果将对数生长期的survivin干扰组Eca-109 /si-survivin、阴性对照组Eca-109 /si-control、空白对照组Eca-109细胞按蛋白抽提要求进行处理，取各组细胞50μg总蛋白进行SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳，随后将分离的蛋白质用半干石墨电转移1.5h至硝酸纤维素膜上，再在室温摇床上用1×磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)配制的50 g·L-1脱脂奶粉封闭1h，加鼠抗人survivin一抗(1∶300)，4℃摇床孵育过夜，PBS洗膜3次，再加入兔抗鼠二抗(1∶2 000)，室温孵育1.5 h，再用PBS洗膜3次，最后在化学发光仪上进行显色，以β-actin作为内参，通过灰度扫描从蛋白表达水平对比观察干扰前后survivin的不同表达。实验重复3次。

2.5MTT法分析5-Fu对细胞生长的影响分别取对数生长期的空白对照组细胞Eca-109、阴性对照组细胞Eca-109 /si-control和survivin干扰组细胞Eca-109 /si-survivin每孔0.5×104个接种于96孔板中，每组接种5孔，待培养12 h细胞贴壁后，加5-Fu液，其质量浓度分别为10、25、50、100、200 mg ·L-1，维持每孔终体积200 μL；待细胞培养48 h后每孔加入MTT 20 μL呈色，继续孵育4 h，终止培养并弃培养液，每孔再加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)，振荡10 min，使结晶物充分溶解；然后在酶标仪上测定490 nm波长处各孔的吸光度A值。细胞生长抑制率(%)=(对照组A490-实验组A490)/对照组A490×100%。最后用IC50计算软件获取3组细胞的半数抑制浓度(IC50)。

2.6流式细胞术测定细胞凋亡率将加5-Fu液培养48 h处于对数生长期的空白对照组、阴性对照组和survivin干扰组细胞分别收集到试管中，按照Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒要求处理各组细胞，取488 nm为激发波长，用流式细胞仪分别测定各组细胞DNA含量，依DNA含量的分布不同进行细胞凋亡率的分析，每组样本重复3次。细胞凋亡率即细胞凋亡指数(AI)=阳性凋亡细胞数/观察细胞总数×100%。

3结果

3.1稳定转染细胞株的筛选转染真核表达质粒pRNAT-siRNA-survivin的Eca-109细胞，经不同质量浓度培养液G418抗性筛选，在倒置荧光显微镜下形成带有绿色荧光蛋白GFP的阳性克隆。见图1。

图1　稳定转染pRNAT-siRNA-survivin质粒的

3.2干扰前后survivin蛋白的不同表达以β-actin为内参，灰度扫描结果显示干扰组Eca-109 /si-survivin细胞survivin蛋白表达水平(18.75±3.12)较阴性对照组Eca-109 /si-control(44.17±3.15)及空白对照组Eca-109 (46.20±2.62)明显下调(P<0.05)；而两对照组相比survivin蛋白表达无统计学差异((P>0.05)。见图2。

图2　Western Blot检测干扰前后

注：1:Eca-109/si-survivin；2:Eca-109 /si-control；3:Eca-109。

3.35-Fu对三组细胞的生长抑制作用MTT分析显示：5-Fu对三组细胞的生长抑制作用呈剂量依赖性；对相同质量浓度的5-Fu，干扰组细胞Eca-109 /si-survivin生长抑制率明显高于空白对照组细胞Eca-109和阴性对照组细胞Eca-109 /si-control，差异具有显著性(P<0.05)；Eca-109 /si-survivin干扰组细胞5-Fu的IC50为(18.75±1.53)mg·L-1，显著低于Eca-109空白对照组(39.65±1.75)mg·L-1和Eca-109 /si-control阴性对照组(38.95±1.34)mg·L-1，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3　MTT检测5-Fu对三组细胞的生长抑制作用

3.4沉默survivin基因对5-Fu诱导细胞凋亡的影响分析结果显示，三组细胞经5-Fu 化疗药物作用后，Eca-109 /si-survivin干扰组平均细胞凋亡率(37.35±1.52)%明显高于Eca-109 /si-control阴性对照组(12.34±1.32)%和未转染Eca-109空白对照组(11.26±1.21)%，差异具有显著性(F=355.459，P<0.05)；而阴性对照组和空白对照组平均细胞凋亡率无显著性差异(P>0.05)。

4讨论

survivin作为近年来新研究发现的抗凋亡基因，具有抑制细胞凋亡的重要生理功能，并参与促进细胞有丝分裂和促进血管的形成[8]。研究表明，survivin基因特异性高表达于人类绝大多数肿瘤尤其是恶性肿瘤组织中，而在成年分化成熟组织和癌旁组织中低表达甚至不表达[9]，通过抑制肿瘤组织内源性survivin的表达，能够诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞生长增殖，进而提高癌细胞对放化疗的敏感性[10-11]。另有研究证实[12-13]survivin基因在食管癌组织中的表达水平显著高于邻近正常食管组织，可能作为一种肿瘤癌基因参与食管癌的发生、发展及转移等病理生理过程。因此，survivin基因很可能与食管癌的发生、发展及诊疗密切相关，有望成为食管癌基因治疗的理想靶点，从而为食管癌患者临床综合治疗开辟新的路径。

RNAi技术是近年来研究哺乳动物细胞基因功能的核心工具，由双链RNA(double strand RNA, dsRNA)介导的特异性抑制同源基因表达的技术，具高度专一性，可产生转录后特定基因沉默的效果[14]；目前RNAi技术已广泛应用于生物工程学、医学及药学研究等众多领域中，为临床众多包括食管癌在内的恶性肿瘤患者开辟了靶向基因治疗的新路径。但目前关于抑制survivin基因表达对食管癌化疗敏感性影响的研究依然较少。

现今临床常用于食管癌化疗的药物是氟尿嘧啶或顺铂，本研究通过构建靶向survivin基因的真核表达载体pRNAT-siRNA-survivin，稳定转染食管癌Eca-109细胞并经化疗药物5-Fu作用后观察细胞效应的变化。结果显示，RNA干扰后Eca-109 /si-survivin干扰组细胞survivin蛋白水平的表达明显低于阴性对照组Eca-109 /si-control和空白对照组Eca-109；与阴性对照组和空白对照组相比，联合应用5-Fu的Eca-109 /si-survivin干扰组细胞IC50显著降低，而联合应用5-Fu的Eca-109 /si-survivin干扰组细胞凋亡率显著增加，提示靶向survivin基因的siRNA和5-Fu具有协同效应，能够大大改善食管癌细胞Eca-109对化疗药物5-Fu的敏感性，其可能机制是促进癌细胞凋亡，抑制癌细胞增殖。因此，本研究主要借助siRNA特异性抑制survivin基因表达为临床食管癌患者的靶向基因治疗和有效化疗提供理论基础。

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Effects of siRNA targeting survivin gene on chemosensitivity of esophageal carcinoma cell Eca-109

NIU Zhao-xia, PENG Rui-rui, CHEN Jie, et al

(DepartmentofPathophysiology,HenanMedicalCollege,Zhengzhou,Henan451191,China)

Abstract:Objective To inhibit survivin gene expression by RNA interference technology and investigate the effects on chemosensitivity of esophageal carcinoma cell Eca-109. Methods siRNA eukaryotic expressing vector targeting specific sequence of survivin gene was constructed to transfect Eca-109 cells which were screened to select the survivin interference group Eca-109 /si-survivin with stable transfection.Meanwhile, the Eca-109 cells transfected with non-sense sequence were used as the negative control group and those untransfected were used as the blank control group.The expression level of survivin protein was detected by western blot to observe the interference effect. Then the cells of each group were treated with different concentrations of fluorouracil (5-Fu) , IC(50 )of 5-Fu in each group was detected by MTT and cell apoptosis rate was analyzed by flow cytometry. Results The survivin protein level (18.75±3.12) of the interference group Eca-109 /si-survivin was effectively lower than that of the negative control group Eca-109 /si-control (44.17±3.15)and the blank control group Eca-109 (46.20±2.62) (P<0.05); IC(50) of 5-Fu in the interference group Eca-109 /si-survivin was(18.75±1.53)mg·L(-1) , which was markedly lower than that of the blank control group(39.65±1.75)mg·L(-1) and the negative control group(38.95±1.34)mg·L(-1) with a statistically significant difference (P<0.05). The cell apoptosis rate of 5-Fu in the interference group Eca-109 /si-survivin was(37.35±1.52)%, which was evidently higher than that of the blank control group(11.26±1.21)% and the negative control group(12.34±1.32)% with a statistically significant difference (P<0.05). Conclusions siRNA targeting survivin can specifically silence the expression of survivin gene, inhibit cell proliferation, induce cell apoptosis, and thus enhance the chemosensitivity of human esophageal cancer Eca-109 cells to 5-Fu.

Key words:small interference RNA;survivin gene;Eca-109 cell;chemosensitivity

(收稿日期：2016-01-15，修回日期：2016-02-13)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.04.018

基金项目：河南省教育厅科学技术研究重点项目(No 14B310002)