绿色木霉固态发酵工艺及诱导条件研究

刘华（广州工商学院，广东广州510000）



绿色木霉固态发酵工艺及诱导条件研究

刘华
（广州工商学院，广东广州510000）

摘要：探讨绿色木霉固态发酵产生纤维素酶的诱导促进条件。通过初始培养基、表面活性剂、诱导物、缓冲pH体系等对绿色木霉固态发酵产酶的诱导情况进行分析，获得产酶时间曲线和最大产酶量。不同条件下绿色木霉产纤维素酶活力存在显著差异（P <0.05），麸皮∶秸秆粉＝1.5∶1（质量比），培养基固液比1∶2.5（g/mL），硫酸铵按培养基干基的2 %加入，初始pH＝6为最佳条件，采用缓冲pH体系对产酶有促进作用，添加表面活性剂和适当种类的诱导物可以提高产酶量，而过高浓度的诱导物则降低产酶量。该研究为绿色木霉对秸秆的转化应用提供了理论依据。

关键词：纤维素酶；绿色木霉；固体发酵

利用微生物讲解玉米秸秆，可以有效提高其综合利用率，同时具有经济、环保特点，已经逐渐成为近年来研究的热点。纤维素酶（cellulase）是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，是一个包含了多种水解酶的复杂的酶系。它在食品、纺织、饲料工业以及医学、能源、生物学、环保等领域应用广泛[1]。固态发酵是国内外研究较多的一种生产酶制剂的方法，与业态发酵相比，具备低成本和较少的运行费用。采用绿色木霉（Trichoderma viride）固态发酵生产纤维素酶由于低成本高产量而成为纤维素酶工业生产的技术发展方向[2]。自然界能够产纤维素酶降解秸秆的微生物包括细菌、真菌、放线菌等，其中由于绿色木霉纤维素酶产量高，稳定性好，培养和控制容易，且分泌的纤维素酶是胞外酶，易于分离纯化，因此是目前用于纤维素酶生产最主要的菌种之一[3-5]。

研究绿色木霉的培养条件及其对纤维素酶活的影响为纤维素酶的工业化生产奠定一些试验基础，为更好地利用秸秆开辟新的途径，这对于加强秸秆资源的充分利用，缓解饲料供求矛盾，促进农业的可持续发展都将具有重要意义[6-7]。本文以绿色木霉为发酵菌种，以稻草秸秆为主要物料，对固态发酵工艺进行研究，探讨固态发酵产酶条件，为绿色木霉对秸秆的转化应用提供了理论参考。

1　材料与方法

1.1菌种

绿色木霉Trichoderma viride。

1.2培养基材料

马铃薯蔗糖琼脂培养基PDA：马铃薯煮汁1000mL，蔗糖20 g，琼脂20 g，pH5.5～6.0。先将新鲜无病害的马铃薯洗净，去皮后切成小薄片，称200 g，加水1 000 mL，煮沸20 min后过滤，其滤汁为马铃薯煮汁。然后加琼脂和蔗糖煮溶，后补足水分至1 000 mL，装管（瓶）灭菌备用；菌种扩大培养的固体培养基：麸皮5 g，秸秆粉5g，Mendels营养液20mL，加水25mL；Mendels营养液：（NH4）2SO41.4 g/L，MgSO40.3 g/L，KH2PO42.0 g/L，CaCl20.3 g/L，尿素0.3 g/L；微量元素：FeSO45.0 mg/L，MnSO41.6 mg/L，ZnSO41.4 mg/L，CoCl22.0 mg/L；0.1 mol/L pH 4.6醋酸-醋酸钠缓冲液：准确称取醋酸钠（CH3COONa·3H2O）和冰醋酸2.60 mL，以蒸馏水溶解，定容至1 000 mL；3，5-二硝基水杨酸显色液：准确称取6.30 g 3，5-二硝基水杨酸，置于2N氢氧化钠262 mL溶液中，然后加酒石酸钾钠的热溶液（182.0 g酒石酸钾钠溶于500 mL水中），再加5.0 g苯酚和0.5 g亚硫酸钠，搅拌至溶解，冷却后定容至1 000 mL，贮存于棕色瓶中，冰箱中备用。0.1 %标准葡萄糖溶液：精确称取经105℃烘至恒重的无水葡萄糖250.0 mg，溶解于蒸馏水中，定容至250 mL。

1.3主要仪器及设备

BS210S型电子天平：北京赛多利斯天平有限公司；PHS-2C型酸度计：上海虹益仪器厂；手提式压力蒸汽消毒器：江阴滨江医疗设备厂；SW-CJ-1F单人双面净化工作台：苏州净化设备有限公司；L1000A型光学显微镜：尼康仪器（上海）有限公司；80-2型离心机：上海悦丰仪器仪表有限公司；DHZ-D冷冻恒温振荡器：广州深华生物技术有限公司；722型分光光度计：上海棱光技术有限公司。

1.4方法

1.4.1培养方法

扩大培养母种：将已灭菌的PDA培养基在无菌工作台摆斜面，静置冷却后，在已有的菌种中挑取菌丝和孢子，接种斜面，置28℃恒温培养箱中培养7 d后移至10℃左右冰箱中保藏。

菌种扩大培养：于无菌工作台将接有母种的PDA斜面中加入10 mL无菌水，并用接种环将培养基上的菌丝和孢子轻刮下，再将含有菌体的水倒入菌种扩大培养的固体培养基中，于28℃培养5 d后，可发现白色菌丝结满整个培养基，培养基表面有大量绿色孢子，培养基严重结块。这时菌种即可作为种子使用。

接种入三角瓶培养：接种操作在无菌工作台进行，接种前先用紫外光对接种台灭菌30 min，并将酒精灯、接种环、移液枪等接种时需要的物品放入同时灭菌。接种前要用75 %的乙醇将台面、使用物品和手进行消毒，接种时应在酒精灯焰所造成的无菌区域内操作。接种时，先将种子培养基中加入100 mL无菌水，并用玻棒捣碎结块的培养基，使菌体和孢子尽量均匀地分布在水中，用移液枪吸取2 mL液体接入三角瓶，接种时应尽量使液体均匀分布在培养基表面。接种完后用5层纱布包扎，放入29℃恒温箱中培养。

1.4.2取样方法

在固体发酵曲中加入蒸馏水100 mL，30℃下抽提1 h，抽提时要将曲尽量捣碎，并定时搅拌，使酶尽可能溶于水中，之后取上清液在4 000 r/min下离心10 min，去除孢子，上清液即为粗酶液，然后测定酶活。

1.4.3分析方法

标准曲线的绘制：分别吸取0.1 %标准葡萄糖溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，分别定容至50 mL。再分别吸取上述溶液各2.5 mL于试管中，各加2.5 mL 3，5-二硝基水杨酸显色液，煮沸5 min（另作一管空白，取2.5 mL蒸馏水，2.5 mL 3，5-二硝基水杨酸显色液，同样煮沸5 min）。冷却后，用721型分光光度计，在530 nm波长下比色，记录各管的光密度值，以光密度为横坐标，对应标准葡萄糖溶液含糖的毫克数为纵坐标，绘制曲线。采用Origin 6.1软件进行线性回归以获得标准曲线，回归结果如表1和图1所示。

表1　葡萄糖标准曲线数据Table 1 The data of glucose standard curve

图1　散点图及线性回归后的直线Fig.1 Scatter plots and straight line after linear regression

Origin 6.1软件的回归结果及误差分析图如图2所示。

图2　Origin 6.1软件的回归结果及误差分析图Fig.2 The chart of Origin 6.1 software regression results and error analysis

所得标准曲线为Y= 0.076 59+0.236 31X，相关系数R＝0.998 97，说明标准曲线拟合较好。

式中：Y为葡萄糖量，mg；X为OD值。

样品测定：精确吸取2.0 mL酶液和3.0 mL缓冲液于试管中，加入1 cm×6 cm新华5号滤纸条一条，50℃水浴加热静止反应1 h。

吸取滤纸酶解液1.0 mL，加蒸馏水1.5 mL，加3，5-二硝基水杨酸显色液2.5 mL于试管中，沸水浴煮沸5 min，冷却后稀释10倍，530 nm处测定OD值。

空白测定：吸取2.0 mL蒸馏水代替2.0酶液，其他操作同样品测定。

1.4.4计算方法

滤纸酶活力/（U/g干基）=

2　结果与分析

2.1秸秆和麸皮的比对绿色木霉固态发酵的影响

一般认为纤维素酶是一种诱导酶，大多采用含有纤维素的原料作为碳源，大多采用含有纤维素的原料作为碳源，常用的粗纤维原料有稻草、秸秆、玉米芯、纸浆、麸皮和糖醛渣等。综合考虑原料来源、成本及效果的考虑，一般采用麸皮和秸秆粉作为碳源。秸秆粉中的纤维素对酶的产生有诱导作用，而麸皮的影响是双方面的：一方面它为产酶提供必要的营养因子；另一方面，其含量的增加又会降低培养基的蓬松程度，是通气量降低，从而影响产酶[8-9]。我们采用不同比例的秸秆粉与麸皮混合，29℃下培养，结果如图3所示，当麸皮与秸秆粉的比例为1.5∶1（质量比）时酶活最高。

图3　麸皮秸秆粉比对产酶的影响Fig.3 Effect of the ratio of bran and straw powder on enzyme production

2.2硫酸铵加入量对产酶的影响

一般的培养基采用尿素、（NH4）2SO4、谷氨酸钠、硝酸钠、蛋白胨作为氮源。有文献记载，采用（NH4）2SO4、谷氨酸钠作为氮源时效果较好[10]。而谷氨酸钠价格昂贵，其产酶活性又与（NH4）2SO4相差不大，而（NH4）2SO4成本较低，故采用（NH4）2SO4作为氮源。

我们在其他条件相同的培养基中加入不同含量的（NH4）2SO4进行比较，如图4，当硫酸铵含量为2 %时效果较好。而在硫酸铵加入量大于2 %时，产酶量反而下降，可能是因为氮源过量使得微生物的生长期过长，而减短了产酶期，导致酶的产量下降。

图4　硫酸铵加入量对产酶量的影响Fig.4 Effect of the quantity of ammonium sulfate for enzyme production

2.3缓冲pH对产酶的影响

在发酵过程中，基质的消耗和微生物代谢物的产生都可能改变培养基的pH，这种改变可能对酶活的产生造成影响。这个试验中，我们选取产酶活较高的初始pH样品做两个采用缓冲溶液配制的对照样，来研究缓冲pH能否提高产酶。结果如表2所示。

表2　缓冲pH对产酶的影响Table 2 Effect of buffer pH on enzyme production

由结果可以看出，使用缓冲溶液可以使酶活得到一定的提高，这可能使因为发酵过程中的产物使pH向不利于产酶的方向改变。但由于酶活的提高幅度较小，在工业生产中是否值得推广要视成本核算而定。

2.4表面活性剂的添加对产酶的影响

表面活性剂可以改变细胞膜的通透性，从而影响纤维素酶的分泌，我们在其他条件相同的培养基中加入不同量的吐温-20和吐温-80，来研究加入表面活性剂对产酶的影响。

表面活性剂的添加对产酶的影响，结果如表3所示。

表3　表面活性剂的添加对产酶的影响Table 3 Effect of surfactants on enzyme production

当吐温-20的加入量较小时对产酶有抑制作用，而加入量较大的时候，对酶有明显的促进作用。加入两种浓度的吐温-80都对产酶有促进作用。这可能是因为表面活性剂对产酶具有两方面影响。一方面，表面活性剂可以增加细胞膜的通透性，加速纤维素酶的分泌；另一方面，表面活性剂对细胞膜的影响导致微生物的生长受到抑制[11-12]。

2.5诱导物的添加对产酶的影响

纤维素酶是一种诱导酶，纤维二糖对产酶应具有诱导作用。本试验采用了不同浓度水平CMC-Na、葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、麦芽糖和醋酸钠作为诱导物，试验二糖和一些单糖及二碳化合物对纤维素酶的影响。试验结果如表4。

表4　不同诱导物对产酶的影响Table 4 Effects of different inducer of enzyme production

从表中的数据可发现，可溶性淀粉的两种浓度水平都对产酶有诱导作用，对酶活有一定的提升，而低浓度水平的CMC-Na和蔗糖对产酶有诱导作用，但浓度过高反而抑制产酶。而麦芽糖和葡萄糖的两种浓度水平都会导致酶活下降。这可能因为高浓度的纤维二糖被菌体利用后产生葡萄糖效应，阻遏微生物合成纤维素酶，从而减少产酶量。至于醋酸钠不属于糖类，但其加入导致酶活大幅下降，估计是醋酸钠对菌体有毒害作用，也可能是醋酸钠作为碱性生理盐使培养基的pH上升的缘故[13-14]。

3　结论

本试验旨在用廉价的农产品及其副产物为木霉菌发酵提供碳、氮成分。试验证明，不同条件下绿色木霉产纤维素酶活力存在显著差异（P <0.05），麸皮∶秸秆粉＝1.5∶1（质量比），培养基固液比1∶2.5（g/mL），硫酸铵按培养基干基的2 %加入，初始pH＝6为最佳条件。由于影响纤维素酶活的因素较多，同时纤维素的降解是一个比较复杂的过程，采用缓冲pH体系对产酶有促进作用，添加表面活性剂和适当种类的诱导物可以提高产酶量，而过高浓度的诱导物则降低产酶量。本文对绿色木霉固态发酵生产纤维素酶的培养条件和诱导因素的研究结果，为提高产酶量提供了一定的理论根据。

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Studies on the Inducing Conditions of Solid-state Fermentation by Trichoderma viride

LIU Hua
（Guangzhou College of Technology and Business，Guangzhou 510000，Guangdong，China）

Abstract：To explore promoting conditions of solid fermentation degrading corn straw by Trichoderma viride. Using Trichoderma viride as experimental materials，the conditions for cellulose production were studied by solid fermentation. The influences of the culture conditions，including medium，a surfactant，inducers，pH buffering system，enzyme-time curve and maximum enzyme production was obtained. The result showed that there was significant difference in cellulase activity produced by Trichoderma viride under different conditions （P<0.05）.It was found that optional conditions for fermentation of corn straw were based on culture at wheat bran and corn straw in the ratio of 1.5∶1（mass ratio），under 6.0 pH，with the medium liquid of 1∶2.5（g/mL），according to the medium dry ammonium sulfate 2 % was added. Using the pH buffer system for enzyme production advantageously，a surfactant is added and appropriate type of inducer enzyme production could be improved，and the high concentration of inducer may decrease the amount of enzyme production. The research provided certain theoretical basis for the transformations and the application of Trichoderma viride on straw.

Key words：cellulase；Trichoderma viride；solid state fermentation

收稿日期：2015-07-23

作者简介：刘华（1982—），女（汉），硕士，研究方向：食品安全与营养检测。

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.08.042