超声波辅助提取吴茱萸生物碱的工艺研究

杨文婷，黄士栩，徐文广，吴士筠（武汉工商学院环境与生物工程学院，湖北武汉430000）



超声波辅助提取吴茱萸生物碱的工艺研究

杨文婷，黄士栩，徐文广，吴士筠*
（武汉工商学院环境与生物工程学院，湖北武汉430000）

摘要：利用响应曲面法对超声波辅助法提取吴茱萸碱和吴茱萸次碱的工艺进行了优化。以吴茱萸碱和吴茱萸次碱提取率为考察指标，通过单因素试验和中心组合设计方法，确定其最佳工艺。最佳条件为35倍体积的60 %乙醇、提取53 min，在此条件下，吴茱萸碱提取率为（0.398 9±0.001 5）%，吴茱萸次碱提取率为（0.761 1±0.001 1）%，与模型预测的理论值接近，说明模型可靠，响应面法优化超声波辅助提取工艺可行。

关键词：吴茱萸；吴茱萸碱；吴茱萸次碱；超声波辅助提取法；响应曲面法

吴茱萸（Tetradium ruticarpum）是芸香料植物吴茱萸的干燥成熟果实[1]，作为一种传统中药[2]，其药用潜力很大。主要活性成分之一是吴茱萸碱和吴茱萸次碱，能抗肿瘤、抗炎镇痛，并对心血管疾病、免疫系统、平滑肌等均有药理作用[2]。随着药理研究的不断深入，其在市场的应用前景非常乐观，目前已出口多个国家。对吴茱萸生物碱提取工艺的研究，可进一步促进其医药用途的开发，为中药吴茱萸的现代化奠定良好的基础。目前对其提取工艺的研究，主要采用热浸法、加热回流法、索氏提取法等[3-7]，本文通过效率高、时间短、操作简单的超声波辅助提取，结合响应面曲面法建立模型[8]，以对吴茱萸碱和吴茱萸次碱提取的关键条件进行优化，以建立安全、稳定、高效的提取工艺，为其深入开发利用提供参考。

1　材料与方法

1.1仪器与试剂

DG120型四两装中药材粉碎机：浙江省瑞安市春海药材器械厂；752型紫外分光光度计、756PC型波长扫描仪：上海光谱仪器有限公司；KQ-100E超声波振荡器：昆山市超声仪器有限公司。

吴茱萸：湖北金新龙中药饮片有限公司；吴茱萸碱对照品、吴茱萸次碱对照品：天津一方科技有限公司。

1.2方法

1.2.1原材料预处理

吴茱萸药材粉碎、过筛，石油醚脱脂4 h，除去溶剂，干燥备用。

1.2.2标准曲线的制作

吴茱萸碱的标准曲线：精密称取吴茱萸碱对照品2.5 mg，用乙酸乙酯配成100 μg/mL的吴茱萸碱母液。在200 nm～500 nm范围进行波长扫描，最大吸收波长为268 nm。分别量取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL母液，乙酸乙酯定容至25 mL，268 nm测吸光度。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制吴茱萸碱的标准曲线。标准曲线方程为A = 0.021 6C+0.000 2，R2=0.998 9。

吴茱萸次碱的标准曲线：精密称取吴茱萸次碱对照品2.1 mg，用乙酸乙酯配成42 μg/mL的吴茱萸碱母液。在200 nm～500 nm进行扫描，最大吸收波长为344 nm。分别量取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL母液，乙酸乙酯定容至25 mL，344 nm测吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制吴茱萸碱的标准曲线。标准曲线方程为y=0.122 4x- 0.002 7，R2= 0.999 5。

1.2.3提取液的制备

称取1份吴茱萸，分别以30倍的溶媒倍数加入70 %乙醇，超声50 min后抽滤，取滤液适当稀释后分别于268、344 nm波长下测吸光度。若吸光度不在吴茱萸碱和吴茱萸次碱的线性范围内则，则适当稀释后再测定。

1.2.4响应面试验设计及数据处理

以单因素试验为基础，确定乙醇浓度、提取时间、溶媒倍数3个因素的不同水平，见表1。

表1　响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels used in response surface expreiments

基于响应面法的中心组合设计，以吴茱萸碱提取率和吴茱萸次碱提取率为响应值，利用Design-Expert 8.0.6软件设计试验并进行数据处理。

2　结果

2.1单因素试验

2.1.1乙醇浓度的确定

分别选取体积分数为40%、50%、60%、70%、80%、90 %的乙醇平行提取、测定，结果见图1。

图1　乙醇浓度对吴茱萸碱和吴茱萸次碱提取率的影响Fig.1 Effect of ethol alcohol concentration on the extraction yield of evodiamine and rutecarpine

随着乙醇浓度的上升，吴茱萸碱与次碱的提取率提高，当乙醇浓度达到60 %时提取率最大，在50 %至70 %范围内，提取率相对较高，从节约溶剂的角度考虑，选取50 %、60 %、70 %作为乙醇浓度这一因素的水平值。

2.1.2提取时间的确定

分别在超声波处理30、40、50、60、70 min后，进行后处理和含量测定，结果见图2。

图2　提取时间对吴茱萸碱和吴茱萸次碱提取率的影响Fig.2 Effect of extracting time on the yield of evodiamine and rutecarpine

随着提取时间的延长，吴茱萸碱和吴茱萸次碱的提取率逐渐增加，不断在向溶剂中溶出，而提取50 min后，提取率增幅度不明显。从能效角度考虑，选择50 min作为提取时间的中心值。

2.1.3溶媒倍数的确定

分别选取溶媒倍数为10、20、30、40、50时进行提取测定，结果见图3。

吴茱萸碱和吴茱萸次碱的提取率随着溶媒倍数的增加有一定提高。若溶剂加入量过少，会导致吴茱萸生物碱无法完全溶出而损失；超声波法对细胞有破损作用，在溶媒倍数达到30倍后，提取率增加不明显，吴茱萸碱和次碱的提取已趋于平衡。

图3　溶媒倍数对吴茱萸碱和吴茱萸次碱提取率的影响Fig.3 Effect of solvent times on the extraction yield of evodiamineand rutecarpine

2.2响应曲面法归方程为吴茱萸碱提取率Y1=-1.308 87+0.026 565X1+ 0.023078X2+0.017295X3-0.0000537X1X2+0.000018X1X3+ 0.00000525X2X3-0.000203X12-0.000185X22-0.00026X32；吴茱萸次碱提取率Y2=-2.7294+0.055719X1+0.047882X2+ 0.032485X3-0.0000898X1X2+0.0000453X1X3+0.000 006 5X2X3-0.000 438X12-0.000 403X22-0.000 513X32。

表2　中心组合试验设计及结果Table 2 Central composite design and experimental results

2.3方差分析结果

吴茱萸碱提取的回归模型方差分析结果见表3，模型F值=121.5，P＜0.000 1，说明模型极其显著；失拟项F值=0.456 3，P=0.727 4＞0.05，说明模型失拟不显著。R2=0.990 9，说明此模型能解释99.09 %的响应值变化，总体模型拟合良好。其中，X2、X3、X1X2、X12、X22和X32的P值达到0.05以下，影响非常显著，其余项影响均不显著，说明溶媒倍数、提取时间以及乙醇浓度和提取时间的交互作用对吴茱萸次碱的提取率影响较大。

表3　吴茱萸碱的方差分析Table 3 Analysis of variance for response surface model about evodiamine

对吴茱萸次碱提取的回归模型进行方差分析，结果见表4。

表4　吴茱萸次碱的方差分析Table 4 Analysis of variance for response surface model about rutecarpine

模型F值=835，P＜0.000 1，表明模型极显著；失拟项F值=3.490，P=0.093 8＞0.05，说明由于纯误差而导致的失拟情况不显著；校准系数R2=0.998 7，说明此模型能解释99.87 %的响应值变化，该模型拟合程度较好。在此模型中，X2、X3、X1X2、X1X3、X12、X22和X32的P值达到0.05以下，对吴茱萸次碱提取率的影响非常显著，说明溶媒倍数和提取时间及乙醇浓度和提取时间的交互作用对吴茱萸次碱的提取影响较大。

根据2.3中方差分析结果，乙醇浓度和提取时间的交互作用对吴茱萸次碱提取率影响显著，为进一步研究其交互作用，利用等高线图和三维曲线图进行可视化分析，结果见图4。

图4　乙醇浓度和提取时间的交互作用对吴茱萸次碱提取率影响的等高线和响应面Fig.4 The contour line and response surface curve of the interaction between ethol concentration and extracting time to rutaecarpine

等高线图呈椭圆形，椭圆越扁平，说明其交互作用影响越大；响应面陡峭，说明吴茱萸次碱对乙醇浓度和提取时间的变化敏感。

2.4验证性试验

根据方程拟合出最佳条件为：溶媒倍数34.59、提取时间53.05 min、乙醇浓度59.87 %，此条件下，吴茱萸碱为0.402 3 %，吴茱萸次碱为0.762 2 %。根据试验可行性做微调，在35倍体积的60 %乙醇中，超声波辅助提取53 min，平行试验3次，吴茱萸碱提取率为（0.398 9±0.001 5）%，吴茱萸次碱提取率为（0.761 1± 0.0011）%，与曲线拟合出的理论值接近。

3　结论

本文利用超声波辅助溶剂提取吴茱萸中的生物碱，超声波能破损植物细胞，使其中的吴茱萸碱和次碱充分释放，使提取充分；超声波辅助提取相对传统热浸或加热回流可以缩短提取时间，简单易行；且提取溶剂选用廉价、安全的乙醇溶液，成本低、无污染，对后期溶剂残留检测要求较低。

响应面曲面法有效克服了正交试验上只能处理离散水平的值的确定。以单因素试验为基础，利用中心组合设计模型建立了吴茱萸碱和吴茱萸次碱提取的回归模型，统计数据和验证试验表明模型能可靠预测两者的提取率。模型预测条件为溶媒倍数34.59、提取时间53.05 min、乙醇浓度59.87 %，所得吴茱萸碱提取率为0.398 9 %，吴茱萸次碱提取率为0.761 1 %，与理论值接近。

参考文献：

[1]国家药典委员会.中国药典(第一部)[M].北京:化学工业出版社, 2010:160

[2]杨云云,郭惠,王昌利.吴茱萸生物碱及其主要成分吴茱萸次碱药理研究进展[J].中药药理与临床,2010,26(5):182-183

[3]王群,刘文,宋信莉,等.多指标优化吴茱萸的提取纯化工艺[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(3):45-47

[4]崔敏,祁洁,杨武德.吴茱萸中吴茱萸次碱的提取工艺及含量测定[J].微量元素与健康研究,2012,29(5):14-16

[5]史艳财,邹蓉,唐辉.吴茱萸中吴茱萸碱和吴茱萸次碱提取工艺及含量测定[J].江苏农业科学,2011,39(3):419-421

[6]陶清,周兴旺,吕鉴泉.正交试验法优化吴茱萸总碱的微波提取[J].天然产物研究与开发,2007,19:494-498

[7]张红梅,王长虹,王峥涛.正交试验法优选疏毛吴茱萸提取工艺[J].中草药,2011,42(10):2001-2004

[8]徐向宏,何明珠.试验设计与Design-Expert、SPSS应用[M].北京:科学出版社,2010:90-98

Optimization of Ultrasonic-assisted Extracting of Evodiamine and Rutaecarpine

YANG Wen-ting，HUANG Shi-xu，XU Wen-guang，WU Shi-jun*
（Environmental and Biological Engineering College of Wuhan Technology and Bussiness University，Wuhan 430065，Hubei，China）

Abstract：The optimum extraction conditions of evodiamine and rutaecarpine from herbs were studied by response curve method. The optimal conditions of ultrasonic-assisted extraction were obtained by one-factor experiment and central composite design，which were 35 times the volume of 60 % ethol alcohol and extracting 53 min. Under the yield of evodiamine was（0.398 9±0.001 5）%，and rutaecarpine was（0.761 1±0.001 1）%，which were consistent with the theory value. The results showed that the model was reliable，and the optimazion method for the extraction was effective.

Key words：Tetradium ruticarpum；evodiamine；rutecarpine；ultrasonic-assisted extraction method；response surface design

收稿日期：2015-03-29

*通信作者:吴士筠（1950—），女，高级实验师，研究方向：天然产物提取及其活性研究。

作者简介：杨文婷（1983—），女（汉），讲师，硕士，研究方向：天然产物提取及其活性研究。

基金项目：武汉工商学院校级科研项目（A2014018）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.08.013