再生纤维素纳米纤维膜的制备及其蛋白质分离性能

凤 权， 武丁胜， 桓 珊， 杨子龙， 应志祥

(安徽工程大学 安徽省纺织面料重点实验室， 安徽 芜湖 241000)

再生纤维素纳米纤维膜的制备及其蛋白质分离性能

凤 权， 武丁胜， 桓 珊， 杨子龙， 应志祥

(安徽工程大学 安徽省纺织面料重点实验室， 安徽 芜湖 241000)

为将纳米纤维膜应用于蛋白质分离处理，用静电纺丝和化学改性方法制备聚丙烯腈/再生纤维素(PAN/RC)复合纳米纤维膜，通过扫描电镜、红外光谱、比表面积及孔径分析等对制备的复合纳米纤维膜进行了表征，并将制备的再生纤维素复合纳米纤维膜作为分离层，构建膜分离系统并分离纯化血清白蛋白，通过调节操作压力和过滤时间等影响因素，确定其分离纯化过程的最佳条件。研究结果表明：在操作压力为0.10 MPa、过滤时间为1.5 h条件下，再生纤维素复合纳米纤维膜对蛋白质的截留率达到80.04%，膜通量达到1.85 L/(m2·min)，与商用聚醚砜超滤膜相比，在截留率差异不大的情况下，膜通量有了数倍的提升；同时再生纤维素复合纳米纤维膜具有优异的重复使用能力，并在使用的过程中保持良好的纳米纤维形态结构。

静电纺丝； 再生纤维素纳米纤维； 蛋白质分离； 膜通量

蛋白质作为生物体的重要组成部分一般存在于相对复杂的溶液体系中，而且在生产过程中，蛋白质对外界环境中的酸碱度、温度等变化较为敏感，易影响到蛋白质的结构而变性[1]。目前，常用于分离纯化蛋白质的方法主要有沉淀法、离子交换法、电泳法、离心法、色谱法等，但是这些方法也存在较多缺陷，例如生产成本较高，工艺过程较为复杂，分离纯化效率较低等，不利于其推广使用[2-4]。近年来，膜分离技术在蛋白质分离纯化过程中，由于工艺简单、处理条件温和、无需添加试剂等优点逐渐引起了人们的关注。在膜分离过程中，通过选择适当的分离膜，调节操作压力和过滤时间等因素，即可快速高效地分离纯化复杂体系中的蛋白质。膜分离技术主要是利用膜两侧存在的推动力，使混合物中原料的组分可透过选择膜而对混合物进行分离、提纯的一种分离过程[5-6]。当前，静电纺丝制备的纳米纤维膜已经成为膜分离方面的研究热点之一[7-9]。利用静电纺丝技术制备的纳米纤维膜，由于纤维直径小，比表面积大，孔隙率较高，在分离纯化蛋白质的过程中能够有效地提高分离纯化效率，降低能耗，有利于膜分离技术得到更广泛的应用[10-12]。

本文主要利用静电纺丝技术制备聚丙烯腈/醋酸纤维素(PAN/CA)复合纳米纤维膜，然后通过化学改性制备聚丙烯腈/再生纤维素(PAN/RC)复合纳米纤维膜即再生纤维素复合纳米纤维膜，将上述纤维膜和聚醚砜(PES)超滤膜作为分离层，分别构建膜分离系统，对同一浓度的血清白蛋白溶液进行膜分离处理。同时，通过静电纺丝和化学改性得到的再生纤维素复合纳米纤维膜孔隙率较高，亲水性能较好，在蛋白质分离纯化过程中能够有效提高膜通量和分离膜的抗污染能力。本文系统地分析了再生纤维素复合纳米纤维膜对牛血清白蛋白溶液的分离性能，为纳米纤维膜应用于蛋白质溶液后处理提供了实验依据。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

聚丙烯腈(PAN，质均相对分子质量为90 000)，分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司；二醋酸纤维素(CA，质均相对分子质量为131 900)，分析纯，购于阿拉丁化学试剂有限公司；N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、NaOH，分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司；考马斯亮蓝(G-250)、血清白蛋白，购于上海金穗生物科技有限公司；

自制高压静电纺丝机(包括注射器、高压电源、滚筒接收装置等)；F-sorb2400型BET比表面积及孔径分析仪；MSC300型国产杯式超滤器(杯体为有机玻璃)及PES超滤膜截留分子质量为50 kDa；S-4800型扫描电子显微镜；日本岛津IR Prestige-21型傅里叶红外光谱仪；DSA-25型光学接触角测量仪。

1.2 PAN/RC复合纳米纤维膜的制备

准确称取3.36 g聚丙烯腈粉末和1.44 g醋酸纤维素切片溶解于35.2 g N，N-二甲基甲酰胺溶剂中，于40 ℃下恒温磁力搅拌至完全溶解，制备质量分数为12% 的均匀纺丝液 (其中PAN与CA的质量比为7∶3)。将PAN/CA复合纺丝液放于注射器中，并将注射器连接于高压直流电源，采用滚筒接收PAN/CA复合纳米纤维(滚筒与地线相接)。其纺丝参数主要设置为：滚筒与注射器之间距离20 cm，注射器喷射速度0.5 mL/h，施加电压18 kV。在上述条件下，连续纺丝20 h后，将收集到的纳米纤维膜放于40 ℃真空干燥箱中干燥2 h，备用。

将上述成功制备的PAN/CA复合纳米纤维膜先后放入0.05 mol/L和0.1 mol/L的NaOH溶液中反应一段时间后，取出，用蒸馏水清洗，然后将其放于40 ℃真空干燥箱中烘干，备用。静电纺丝PAN/CA复合纳米纤维膜经过2次水解改性，从而制备PAN/RC复合纳米纤维膜，即再生纤维素复合纳米纤维膜。

1.3 纳米纤维膜的性能表征

1.3.1 纳米纤维膜形貌观察

采用日本日立公司的S- 4800型扫描电子显微镜对各种待测纳米纤维膜进行形貌观察，测试前对待测纤维膜样品进行喷金处理。

1.3.2 纳米纤维膜红外光谱测定

按照红外光谱测试要求，制备各种纳米纤维膜测试样品，利用日本岛津公司的IR Prestige-21型傅里叶红外光谱仪对各种复合纳米纤维膜进行红外光谱分析，测试各纤维中的功能性基团。

1.3.3 纳米纤维膜比表面积及孔径测试

参考GB/T 9587—2004《气体吸附BET法测定固态物质的表面孔》按比表面积及孔径测试要求，制备PAN/RC纳米纤维膜测试样品，采用美国康塔NOVA 2000e型比表面积及孔径分析仪测试纳米纤维膜的比表面积和孔径。

1.4 膜分离系统的构建

为分析再生纤维素复合纳米纤维膜对蛋白质溶液分离纯化的能力，将相同厚度的复合纳米纤维膜(再生纤维素纳米纤维膜测定的孔体积、平均孔径、BET比表面积分别为0.05 mL/g、32.55 nm、28.57 m2/g)和商业使用的PES超滤膜作为分离膜，分别构建膜分离系统，其结构示意图如图1所示[13]。其中，将锦纶导流网作为支撑层，再将分离膜覆盖于上层，然后血清白蛋白溶液会在一定的压力驱动下选择性透过分离膜，达到分离纯化蛋白质的效果。

1.5 膜分离性能的测定

准确称取一定质量的血清白蛋白样品溶于蒸馏水中，完全溶解制备1 mg/mL的血清白蛋白溶液。分别将4层的PAN/RC纳米纤维膜和PES超滤膜作为过滤层，构建膜分离系统分离纯化血清白蛋白溶液。通过调节实验中的压强和过滤时间等影响因素，测定2种分离膜对血清白蛋白的截留率和溶液透过通量，用于评价2种纳米纤维膜分离纯化血清白蛋白能力的强弱。其中，蛋白质截留率[14]是指溶液中血清白蛋白被膜截留的量与所占溶液中总量的比率，具体计算如下式所示：

式中：C0表示膜分离前溶液中蛋白质的初始质量浓度，mg/mL；CP表示膜分离后滤过液中蛋白质的质量浓度，mg/mL。

膜通量，即溶液透过通量是指在单位时间、单位面积的分离膜透过的溶液体积，用下式计算：

式中：V表示滤过液的体积，L；S表示分离膜的有效面积，m2；t表示膜分离的操作时间，min。

1.5.1 分离时间的影响

当操作压力为0.1 MPa时，磁力搅拌器的转速设置为100 r/min，分别测定不同过滤时间下再生纤维素复合纳米纤维膜和PES超滤膜的膜通量和蛋白质截留率，实验采用1 mg/mL的血清白蛋白溶液作为待过滤液。

1.5.2 压力的影响

当蛋白质过滤时间均为90 min，操作压力在0.04～0.12 MPa之间变化时，研究操作压力对膜通量和蛋白质截留率的影响。

1.5.3 纳米纤维膜重复使用性能测试

分别用再生纤维素纳米纤维膜和商业PES超滤膜分离1 mg/mL的血清白蛋白溶液，在0.1 MPa的操作压力下过滤分离90 min，取出纳米纤维膜用蒸馏水清洗3～5次，然后在相同条件下将纳米纤维膜重复测试5次，计算每次分离过程中的膜通量和蛋白质截留率。

2 结果与讨论

2.1 PAN/RC复合纳米纤维膜的性能分析

2.1.1 PAN/RC复合纳米纤维膜形貌

利用静电纺丝和水解改性制备PAN/RC复合纳米纤维膜，并将其用于分离纯化血清白蛋白，将分离纯化血清白蛋白前后的复合纳米纤维膜通过扫描电镜观察纤维表观形态，结果如图2所示。由图可知，经过静电纺丝和水解改性可成功制备纤维成形良好、直径均匀的再生纤维素复合纳米纤维膜。同时，PAN/RC复合纳米纤维膜在分离纯化血清白蛋白溶液的过程中，其纤维的外观形态依然保持稳定，并没有出现明显的溶胀损坏现象，但是纤维直径略微变大，原因是复合纳米纤维上覆有少量血清白蛋白，从而使纤维略微变粗。

2.1.2 纳米纤维膜的红外光谱分析

2.2 复合纳米纤维膜的分离性能

本文实验采用静电纺丝和水解改性制备再生纤维素纳米纤维膜分离血清白蛋白溶液，主要以蛋白质截留率和溶液透过通量来表征膜分离性能。在膜分离过程中，操作压力、处理时间、膜孔径大小及其分布、溶液流速等因素都极大地影响着膜分离性能[15]。本文主要研究膜分离过程中的操作压力和分离时间与蛋白质的截留率和溶液透过通量之间的关系，同时，本实验采用考马斯亮蓝法测定溶液中蛋白质的含量。

2.2.1 膜分离时间对蛋白质分离纯化的影响

当操作压力恒定为0.1 MPa时，纳米纤维膜分离血清白蛋白时间与膜透过通量和蛋白质截留率之间的关系如图4所示。由图可知，随过滤时间的延长，PAN/RC纳米纤维膜和PES超滤膜的膜通量均呈下降趋势，原因是纤维膜在分离蛋白质溶液过程中，随分离时间的增加，溶液流动阻力也在逐渐增大，由于纤维膜表面产生吸附阻力、沉积阻力以及浓差极化现象从而降低了膜通量[16]。同时，再生纤维素纳米纤维膜的膜通量是PES超滤膜膜通量的4倍左右， 即在相同的操作压力下，再生纤维素纳米纤维膜分离血清白蛋白的速度更快。分析蛋白质截留率与分离时间的关系发现，随分离时间的增加，再生纤维素纳米纤维膜对血清白蛋白溶液的截留率逐渐变大，最高达到80.04%，具备较高的截留率。

2.2.2 操作压力对蛋白质分离纯化的影响

将PAN/RC纳米纤维膜和PES超滤膜在0.04～0.12 MPa压强下过滤90 min后，计算2种纳米纤维膜的膜通量和截留率的变化情况，如图5所示。由图可知，当过滤时间相同，操作压力不同时，2种纤维膜分离纯化血清白蛋白性能各不相同。当操作压力较小时，由于纳米纤维膜本身在分离过程中对溶液流动产生一定的过滤阻力，因此PAN/RC纳米纤维膜和PES超滤膜在分离初期的膜通量都较低；随着压力的增大，血清白蛋白溶液流动的动力增加，因此2种纳米纤维膜的膜通量都增大，但再生纤维素纳米纤维膜的膜通量增加速率更快。由图5还可看出，在相同分离时间、不同的操作压强条件下，再生纤维素纳米纤维膜的膜通量始终高于PES超滤膜。观察蛋白质截留率变化发现，在相同分离时间的条件下，随操作压强的增加，再生纤维素纳米纤维膜和PES超滤膜均保持较高截留率，纳米纤维膜截留率虽出现小幅波动但基本保持平稳。当分离时间一定，在0.1 MPa操作压力下，纳米纤维膜可高效分离血清白蛋白。当操作压力继续增加时，纳米纤维膜有少许损坏，造成蛋白质流失。

在实际的蛋白质分离纯化过程中，膜分离系统应保证在较高的截留率基础上，能大幅提高其处理效率，这样才能更好地运用到社会生活中，因此选择在90 min的过滤时间内，0.1 MPa操作压力下，PAN/RC纳米纤维膜可高效地分离纯化血清白蛋白。

2.2.3 纳米纤维膜重复使用性能

在操作压力为0.1 MPa，过滤时间为90 min的条件下，2种纤维膜重复使用性能测试结果如图6所示。

由图6可知，随着重复使用次数的增加，2种分离膜的的分离性能基本保持稳定。同时再生纤维素纳米纤维膜经过5次重复分离血清白蛋白实验后，其蛋白质截留率虽略低于商业PES超滤膜，但膜通量是商业PES超滤膜膜通量的4倍左右，而且也具备优良的重复使用能力。

3 结 论

本文研究采用静电纺丝制备PAN/CA复合纳米纤维膜，再经水解制备PAN/RC复合纳米纤维膜即再生纤维素复合纳米纤维膜。

再生纤维素纳米纤维膜由于引入羟基等功能性基团，不仅能改善纤维膜本身的浸润性、耐污染性，而且具有良好的生物相容性。基于再生纤维素纳米纤维膜构建的膜分离系统，用于分离血清白蛋白溶液，其蛋白质的截留率可达到 80.04%，膜通量能达到 1.85 L/(m2·min)，与PES超滤膜分离纯化血清白蛋白相比，在维持较高截留率的基础上，膜通量得到大幅提高，而且该纳米纤维膜可多次重复使用。实验结果表明，再生纤维素纳米纤维膜在蛋白质分离纯化预处理上具有显著的应用价值。

FZXB

[1] 罗鸣，尚闽，郑祥. 蛋白截留法评价超滤膜分离性能研究[J]. 膜科学与技术, 2014(6): 56-61. LUO Ming, SHANG Min, ZHENG Xiang. Discussion about assessment of ultrafitration memebranes retention performance by seprating protein method[J]. Membrane Science and Technology, 2014(6): 56-61.

[2] 吕晓龙.中空纤维多孔膜性能评价方法探讨[J].膜科学与技术, 2011(2):1-6. LÜ Xiaolong. Discuss about the measure methods for performance of hollow fiber porous membranes[J]. Membrane Science and Technology, 2011(2):1-6.

[3] 凤权，汤斌. 粘杆菌素发酵液微滤膜分离处理过程研究[J]. 生物学杂志，2010，27(1): 43 -46. FENG Quan, TANG Bin. Research on colistin fermentation broth treatment with microfitration memberane separation technology[J]. Journal of Biology, 2010, 27(1): 43 -46.

[4] 周建军，张欢，何明. 纤维素基吸附分离材料研究进展[J]. 高分子通报，2015(6)：29-36. ZHOU Jianjun, ZHANG Huan, HE Ming. Research advances of cellulose-based adsorption and separation material[J]. Polymer Bulletin, 2015(6)：29-36.

[5] 姚红娟，王晓琳. 膜分离技术在低分子量生物产品分离纯化中的应用[J]. 化工进展，2003(2)：146-152. YAO Hongjuan, WANG Xiaolin. Membrane separation technology and its application in purifying and separating bioproducts with low molecular weights[J]. Chemical Industry and Engineering Progress, 2003(2)：146-152.

[6] 凤权, 王清清, 魏取福, 等. Cd2+-PVA/PA6金属配合纳米纤维的制备及反应动力学分析[J]. 纺织学报, 2012, 33(3): 5-8. FENG Quan, WANG Qingqing, WEI Qufu, et al. Preparation of Cd2+-PVA/PA6 metal chelated nanofibers and analysis of reaction kinetics[J]. Journal of Textile Research, 2012, 33(3): 5-8.

[7] FENG Quan, HOU Dayin, ZHAO Yong, et al. Electrospun regenerated cellulose nanofibrous membranes surface-grafted with polymer chains/brushes via the ATRP method for catalase immobilization[J]. ACS Applied Materials & Interfaces, 2014, 6:20958-20967.

[8] LU P，HSIEH Y L. Lipase bound cellulose nanofibrous membrane via cibacron blue F3GA affinity ligand [J]. Journal of Membrane Science，2009，330(1/2): 288 -296.

[9] FENG Q，WEI Q F，HOUD Y，et al. Preparation of amidoxime polyacrylonitrile nanofibrous membranes and their applications in enzymatic membrane reactor[J]. Journal of Engineered Fibers and Fabrics，2014，9(2): 146-152.

[10] FENG Q，WANG X Q，WEI A F，et al. Surface modified ployacrylonitrile nanofibers and application for metal ions chelation[J]. Fibers and Polymers，2011，12(8): 1025-1029.

[11] 梁斌，王建强，潘凯，等. 静电纺丝纳米纤维在膜分离中的研究进展[J]. 高分子通报，2013(4)：99-107. LIANG Bin, WANG Jianqiang, PAN Kai, et al. Development of electrospinning nanofibers for membrane separation[J]. Polymer Bulletin, 2013(4)：99-107.

[12] 凤权, 侯大寅, 毕松梅. AOPAN纳米纤维金属离子配合性能及动力学分析[J]. 东华大学学报(自然科学版), 2015, 41(2): 143-147. FENG Quan, HOU Dayin, BI Songmei. Properties of the AOPAN nanofibers for the metal ions chelation and kinetics analysis[J]. Journal of Donghua University(Natural Science), 2015, 41(2): 143-147.

[13] 凤权, 魏安静, 侯大寅, 等. 基于AOPAN纳米纤维膜的粘杆菌素发酵液后处理研究[J]. 生物学杂志, 2014, 31(5): 89-92. FENG Quan, WEI Anjing, HOU Dayin,et al. Study on preparation of AOPAN nanofibrous membrane and their applications for filtration treatment of colistin fermentation broth[J]. Journal of Biology, 2014, 31(5): 89-92.

[14] 侯娟，邵嘉慧，何义亮. 溶液环境对荷电超滤膜和传统中性超滤膜去除天然有机物的影响[J]. 环境科学，2010，31(6)：1518-1525. HOU Juan, SHAO Jiahui, HE Yiliang. Comparison of the effect of solution environment on humic acid removal behavior with charged and traditional neutral ultrafiltration membranes[J]. Environmental Science, 2010，31(6)：1518-1525.

[15] RAJESH S, MAHESWARI P, SENTHILKUMAR S, et al. Preparation and characterization of poly(amide-imide) incorporated cellulose acetate membranes for polymer enhanced ultrafiltration of metal ions[J]. Chemical Engineering Journal, 2011, 171(5): 33-44.

[16] LAKSHMI K, PATHAN M A, RASHEETH A. Separation of proteins from aqueous solution using cellulose acetate/poly(vinyl chloride) blend ultrafiltration membrane[J]. Journal of Membrane Science，2011, 46:2914-2921.

Preparation and protein separation properties of regenerated cellulose nanofiber membrane

FENG Quan, WU Dingsheng, HUAN Shan, YANG Zilong, YING Zhixiang

(AnhuiProvincialKeyLaboratoryofTextileFabric,AnhuiPolytechnicUniversity,Wuhu,Anhui241000,China)

Polyacrylonitrile/ regenerated cellulose (PAN/RC) composite nanofibers membrane were prepared by electrospinning and chemical modification for the separation and purification of serum albumin. Composite nanofiber membranes were characterized by scanning electron microscopy, infrared spectroscopy, specific surface area and pore size analysis. The membrane separation system was assembled by the PAN/RC composite nanofiber membrane, which was overlaid to form the reaction layer. The optimal condition of the protein separation were analyzed by adjusting the operating pressure, filtration time and the pH value. Results showed that the rejection rate of serum albumin and flux of membrane could reach 80.04% and 1.85 L/(m2·min), respectively, under the following conditions: the operating pressure was 0.10 MPa, and the processing time was 1.5 h. Compared with the polyether sulphone commercial ultrafiltration membranes, the rejection rate decreased slightly, while the transport flux improved by several times. At the same time, the experimental results indicated that the regenerated cellulose nanofiber membrane possessed excellent reusability. Additionally, the regenerated cellulose nanofiber membrane could well retain the nanofiber morphological structure after the separation of serum albumin for several times in aqueous environment.

electrospinning; regenerated cellulose nanofiber; separation of protein; flux

10.13475/j.fzxb.20151203906

2015-12-31

2016-08-14

国家自然科学基金项目(21377004)；安徽省自然科学基金项目(1408085ME87)；安徽省高校自然科学研究项目(KJ2016SD04)；安徽省科技计划项目(1604b0602024)

凤权(1975—)，男，副教授，博士。 主要研究方向为功能性纳米纤维。E-mail: fengquan@ahpu.edu.cn。

TQ 342

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