我国结核分枝杆菌gyrA不同突变类型对氟喹诺酮类药物耐药水平的相关性研究

张治国 杜春英 张倩 王玉峰 逄宇 赵雁林



·论著·

我国结核分枝杆菌gyrA不同突变类型对氟喹诺酮类药物耐药水平的相关性研究

张治国 杜春英 张倩 王玉峰 逄宇 赵雁林

目的 研究gyrA基因在我国耐氟喹诺酮类药物结核分枝杆菌菌株中的突变特征，以及不同突变类型与氟喹诺酮类药物最低抑菌浓度(MIC)的关系。 方法 2007年我国开展结核病耐药基线调查，调查选取了70个调查点，共分离结核分枝杆菌4017株，其中145株为对氧氟沙星耐药的结核分枝杆菌菌株，有7株菌株在传代中发生污染或传代失败，本研究共纳入138株对氧氟沙星耐药的结核分枝杆菌菌株。对上述菌株的氟喹诺酮类药物耐药相关基因(gyrA)进行测序，分析耐药相关基因突变的特征；用微孔板稀释法检测这些菌株对氧氟沙星、左氧氟沙星和莫西沙星的MIC，统计不同突变类型菌株对氟喹诺酮类药物耐药率的差别。采用SPSS 11.0统计软件进行统计学处理，同种突变类型对不同氟喹诺酮类药物耐药率的比较采用Fisher确切概率法进行检验，以P<0.05为差异有统计学意义。 结果 在138株氧氟沙星耐药菌株中，总计有90株(65.2%)检测到氟喹诺酮类药物耐药相关基因gyrA发生突变，其中最常见的突变发生在第94位点(34.8%，48/138)。gyrA基因第88、89和91这3个位点的突变菌株(分别为2株、3株和5株)，除莫西沙星有2株在91位点表现为高水平耐药，其余均表现为对3种氟喹诺酮类药物低水平耐药；第94位点突变类型较多，导致不同的耐药水平，第94位点天冬氨酸突变为天冬酰胺时氧氟沙星、左氧氟沙星和莫西沙星的高水平耐药比例分别为80.0%(8/10)、30.0%(3/10)和100.0%(10/10)；此外，1株第94位点天冬氨酸突变为半胱氨酸的菌株同时表现为对3种氟喹诺酮类药物的高水平耐药；而第94位点突变为丙氨酸时与低水平氟喹诺酮类药物耐药有关，其对氧氟沙星、左氧氟沙星和莫西沙星低水平耐药率分别为91.7%(11/12)、100.0%(12/12)和58.3%(7/12)。 结论gyrA基因突变是我国人群对氟喹诺酮类药物耐药菌株最主要的耐药机制，不同gyrA突变类型导致对氟喹诺酮类药物不同的耐药水平。

分枝杆菌，结核； 氟喹诺酮类； 氧氟沙星； 基因型； 抗药性，细菌

结核病仍然是全世界重要的公共卫生问题之一[1]。据世界卫生组织估计，全球每年约有960万例新发患者及145万例死于结核病的患者，我国是全球22个结核病高负担国家之一，约占全球结核病负担的10%[2]。氟喹诺酮类药物是二线抗结核药物的重要组成部分，由于其在体内具有较好的早期灭菌效果，因此被推荐作为备选药物以缩短结核病患者的化疗时间[3]。氟喹诺酮类药物在MTB中的作用位点为DNA拓扑异构酶，上述酶包括A和B两个亚基，分别由gyrA和gyrB两个基因编码[4]。研究表明，氟喹诺酮类药物耐药的主要机制为gyrA基因突变引起[5-6]。

目前，关于MTB中gyrA突变的报道较多[5-6]，而氟喹诺酮类药物最低抑菌浓度(MIC)与gyrA不同突变位点的关系报道较少，本研究选取全国耐药基线调查收集的对氧氟沙星耐药的菌株为研究对象，分析gyrA基因在我国对氟喹诺酮类药物耐药菌株中的突变特征，以及不同突变类型与不同氟喹诺酮类药物MIC的关系。

材料和方法

一、菌株

本实验所选取的138株对氧氟沙星耐药的MTB菌株由中国疾病预防控制中心国家结核病参比实验室提供，来自于2007年全国结核病耐药性基线调查[7]。选取的过程为：根据流行病学抽样原则，从全国31个省、自治区、直辖市(不含中国台湾、香港和澳门地区)，采用分层整群抽样的方法抽取70个调查点，每个调查点纳入当年新诊断的涂阳结核病患者，假定初治和复治肺结核患者对利福平的耐药率为6%和16%计算，估算纳入初治和复治患者最低样本量为3010例和1010例；考虑到调查点数量，每个调查点纳入初治患者51例，复治患者17例，共纳入4760例患者。经过培养鉴定，总计分离获得4017株MTB菌株，所有菌株进行了传统比例法药物敏感性试验(简称“药敏试验”)及对硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)菌种鉴定，共获得145株对氧氟沙星耐药的MTB菌株，但有7株菌株在传代中发生污染或传代失败。因此，总计138株对氧氟沙星耐药的菌株纳入本研究。标准菌株H37Rv为国家结核病参比实验室保藏菌株。

二、试剂来源

本试验所用改良罗氏培养基购自于珠海贝索生物技术有限公司；药敏试验所用氧氟沙星、左氧氟沙星和莫西沙星均购自于美国Sigma公司，使用时按照厂家提供的纯度和效价计算用量；7H9培养基药粉和营养添加剂购自于美国碧迪医疗器械有限公司；Alamar blue显色剂购自于美国伯乐生命医学有限公司；2×Taq预混液购自于北京康为世纪生物科技有限公司；所有引物均由北京擎科生物技术有限公司合成。

三、药物MIC测定

按照文献[8]所述，选用微孔板稀释法进行MTB的MIC检测；选取改良罗氏培养基上生长3～4 周的新鲜菌落，使用磨菌瓶分散均匀，并稀释菌液至1个麦氏浓度(～107CFU/ml)，再以1∶20稀释后向微孔板加入100 μl 菌液。微孔板于37 ℃ 孵育7 d后，在实验微孔板中加入70 μl预混的显色液(含20 μl Alamar blue和50 μl 5.0% Tween-80)，37 ℃ 孵育24 h记录各孔的颜色；蓝色孔为无MTB生长，粉色孔为有MTB生长。能抑制MTB生长(蓝色孔)的最低药物浓度即为最低抑菌浓度。氧氟沙星、左氧氟沙星和莫西沙星3种药物的浓度均设置0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32和64 μg/ml 10个测试工作浓度。参照文献[9]，氧氟沙星、左氧氟沙星和莫西沙星的临界浓度分别为2 μg/ml、2 μg/ml 和0.5 μg/ml；对于氧氟沙星和左氧氟沙星，当MIC≥8 μg/ml时，定义为高浓度耐药；对于莫西沙星，当MIC≥2 μg/ml时，定义为高浓度耐药。

四、基因组DNA提取

根据文献[7]所述，采用简单水煮法提取MTB基因组DNA。从改良罗氏培养基斜面使用接种环刮取MTB菌落，将菌落转移至带有1 ml 生理盐水的无菌Eppendorf离心管中，80 ℃ 30 min 灭活，12 000×g离心5 min，去上清，菌体沉淀用500 μl TE(Tris-EDTA buffer solution)缓冲液(pH=8.0)充分悬浮，100 ℃沸水浴30 min，冷却至室温后，12 000×g离心5 min，取上清即为基因扩增模板。

五、gyrA基因扩增和测序

扩增对氟喹诺酮耐药的相关基因gyrA基因片段(415 bp)，扩增体系如下：2×Taq预混液25 μl，上游引物(5′-TCGACTATGCGATGAGCGTG-3′)0.2 μmol，下游引物(5′-GGTAGCACCGTCGGCTCTTG-3′)0.2 μmol，基因组DNA 5 μl，剩余体积使用双蒸水(ddH2O)补平到总体积50 μl。基因扩增条件如下：预变性94 ℃ 5 min；循环94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 延伸10 min。基因扩增产物电泳检测后送北京擎科生物技术有限公司测序。测序结果以标准敏感菌株H37Rv基因序列作为标准，通过美国国立卫生研究院在线序列比对软件(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行比较。

六、统计学分析

采用SPSS 11.0统计软件进行统计学处理，同种突变类型对不同氟喹诺酮类药物耐药率的比较采用Fisher确切概率检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、对氟喹诺酮类药物耐药的菌株中gyrA基因突变特征分析

在138株对氧氟沙星耐药的菌株中，总计有90株(65.2%)检测到对氟喹诺酮类药物耐药的相关基因gyrA发生突变。其中最常见的突变发生在第94位点(34.8%，48/138)，上述突变导致第94位的天冬氨酸突变为甘氨酸(12.3%，17/138)、丙氨酸(8.7%，12/138)、天冬酰胺(7.2%，10/138)、酪氨酸(3.6%，5/138)、组氨酸(2.2%，3/138)或者半胱氨酸(0.7%，1/138)；除了第94位点突变外，第90位点氨基酸突变是第二常见的突变类型，占全部菌株的23.2%(32/138)，其突变类型均为丙氨酸突变为缬氨酸；此外，还有5株突变发生在第91位点，3株在第89位点及2株在第88位点(表1)。

二、不同突变类型菌株对氧氟沙星耐药情况分析

如表2所示，对于不同位点的氨基酸突变，第88、89和91这3个位点的突变菌株均表现为对氧氟沙星低水平耐药(MIC<8 μg/ml)；第90位点丙氨酸突变为缬氨酸，有75.0%(24/32)的菌株表现为对氧氟沙星低水平耐药；第94位点突变类型较多，且呈现出对氧氟沙星不同的耐药特征，其中第94位点天冬氨酸突变为天冬酰胺、甘氨酸及组氨酸引起高水平耐药的比例较高，分别有8/10、13/17和2/3的突变菌株对氧氟沙星的MIC≥8 μg/ml；而当第94位点天冬氨酸突变为丙氨酸和酪氨酸时，MTB菌株通常表现为低水平耐药，分别有11/12和3/5的突变菌株对氧氟沙星的MIC<8 μg/ml。

表1 对氟喹诺酮类药物耐药MTB的gyrA基因突变情况

注 Ala：丙氨酸；Asn：天冬酰胺；Val：缬氨酸；Pro：脯氨酸；His：组氨酸；Tyr：酪氨酸；Gly：甘氨酸；Cys：半胱氨酸；Asp：天冬氨酸；Ser：丝氨酸

三、不同突变类型菌株对左氧氟沙星耐药情况分析

不同突变类型的MTB菌株对左氧氟沙星耐药情况的分析如表3所示，其中与氧氟沙星类似，第88、89和91这3个位点的突变均表现为对左氧氟沙星低水平耐药。与氧氟沙星不同，在其他多种突变类型中，第90位点丙氨酸突变为缬氨酸、第94位点天冬氨酸突变为天冬酰胺及甘氨酸对左氧氟沙星高水平耐药的比率分别为3.1%(1/32)、30.0%(3/10)和5.9%(1/17)，除94位点天冬氨酸突变为天冬酰胺外，均显著低于氧氟沙星的耐药比率(均为确切概率法，P值分别为0.0265、0.0698、0.000)。此外，第94位点天冬氨酸突变为半胱氨酸表现出对左氧氟沙星高水平耐药，其MIC为8 μg/ml。

表2 MTB不同gyrA基因突变类型与对氧氟沙星耐药的关系(株数)

注 Ala：丙氨酸；Asn：天冬酰胺；Val：缬氨酸；Pro：脯氨酸；His：组氨酸；Tyr：酪氨酸；Gly：甘氨酸；Cys：半胱氨酸；Asp：天冬氨酸；Ser：丝氨酸

表3 MTB不同gyrA基因突变类型与对左氧氟沙星耐药的关系(株数)

注 Ala：丙氨酸；Asn：天冬酰胺；Val：缬氨酸；Pro：脯氨酸；His：组氨酸；Tyr：酪氨酸；Gly：甘氨酸；Cys：半胱氨酸；Asp：天冬氨酸；Ser：丝氨酸

四、不同突变类型菌株对莫西沙星耐药情况分析

如表4所示，带有不同gyrA基因突变的菌株对莫西沙星耐药水平表现出较大的差异。其中第88位点、第89位点、第90位点和第91位点基因突变通常与低水平莫西沙星耐药相关，其低水平耐药菌株比例分别为2/2、3/3、25/32和3/5；第94位点由天冬氨酸突变为组氨酸(3/3)、天冬酰胺(10/10)、甘氨酸(12/17)和半胱氨酸(1/1)引起高水平莫西沙星耐药，而突变为酪氨酸和丙氨酸时，共计58.8%(10/17)的菌株表现为对莫西沙星低水平耐药。

讨 论

本研究首次基于我国对氟喹诺酮类药物耐药的菌株系统开展了基于不同突变类型与耐药水平相关性的研究，初步获得了一些具有指导性意义的数据。

一、gyrA基因突变是我国对氟喹诺酮类药物耐药菌株的最主要耐药机制

氟喹诺酮类药物在MTB中的靶标基因为DNA拓扑异构酶A亚基(gyrA)，该基因突变大多发生在基因保守区第67～106位密码子区，常见的有第88位点、第90位点、第91位点、第94位点突变[3]。本研究结果表明，我国65.2%的对氧氟沙星耐药的MTB菌株是由于gyrA基因突变引起的，上述比率与之前来自北京(68%)[10]、纽约(67%)[11]的比率较接近，低于俄罗斯(83%)[12]和上海(76%)[13]，而高于我国台湾地区(50%)[14]和突尼斯(50%)[13]，导致上述差异可能是由于gyrA基因的突变存在地区性差异，与当地主要流行的MTB菌株不同有关。近年来，陆续开发了多个基于分子生物学的检测方法用于快速检测MTB对氟喹诺酮类药物耐药的情况，上述检测方法主要基于对gyrA基因耐药相关决定区的检测[15]。然而，本研究结果表明上述检测方法在我国检测的敏感度可能不甚理想，有超过30%的氟喹诺酮类药物耐药患者可能未能被检测到(共计138株，90株有突变，48株无突变，无突变率34.8%)，这可能导致患者的治疗延迟。因此，迫切需要针对我国分离的对氟喹诺酮类药物耐药的菌株进行系统研究，以揭示上述不带有gyrA基因突变的对氟喹诺酮类药物耐药菌株的耐药机制，从而为开发适于我国的新诊断试剂盒提供重要的理论依据。

表4 MTB不同gyrA基因突变类型与对莫西沙星耐药的关系(株数)

注 Ala：丙氨酸；Asn：天冬酰胺；Val：缬氨酸；Pro：脯氨酸；His：组氨酸；Tyr：酪氨酸；Gly：甘氨酸；Cys：半胱氨酸；Asp：天冬氨酸；Ser：丝氨酸

二、gyrA基因不同突变类型引起不同水平的对氟喹诺酮类药物耐药

与前述报道一致，第94位点氨基酸突变是我国最常见的突变类型[3, 10-11]，其次是第90位点氨基酸突变。有前述研究表明，第90位点和第94位点氨基酸突变通常引起高水平耐药[12]；但是本研究结果表明，第90位点丙氨酸突变为缬氨酸时，大多数菌株对氧氟沙星的MIC低于4 μg/ml，这可能是由于丙氨酸和缬氨酸同属于非极性氨基酸，两者在结构、电性等方面具有很相似的特征。因此，上述氨基酸的改变没有引起gyrA与氟喹诺酮类药物结合能力的显著改变，进而未能导致高水平的MIC；对于第94位点而言，当天冬氨酸突变为天冬酰胺、甘氨酸和半胱氨酸时通常引起高水平的对氧氟沙星、莫西沙星耐药；而突变为丙氨酸和酪氨酸时，通常引起低水平的对3种氟喹诺酮类药物耐药，可能与氨基酸性质差别有关，天冬氨酸为酸性氨基酸，而天冬酰胺、甘氨酸和半胱氨酸均为非电离的极性氨基酸。因此，上述氨基酸存在较大的差异，导致氟喹诺酮类药物靶标gyrA结构的显著改变，从而影响了MIC；与之相反，丙氨酸与酪氨酸均属于非极性氨基酸，与天冬氨酸性质相似，因此，未能显著影响MTB对氟喹诺酮类药物的耐药水平。此外，第88位点、第89位点及第91位点突变均为低水平的对氟喹诺酮类药物耐药，虽然上述位点中第89位由天冬氨酸突变为天冬酰胺，这两种氨基酸性质差别较大，但是未能引起高水平的对氟喹诺酮类药物耐药，可能与上述位点并非氟喹诺酮类药物和gyrA结合的主要位点。

三、其他耐药机制可能影响MTB对氟喹诺酮类药物耐药

本研究表明，我国约有35%对氟喹诺酮类药物耐药的MTB菌株没有携带gyrA基因突变，推测上述菌株可能由于以下原因产生耐药性：(1)部分菌株由于携带gyrB突变导致耐药；(2)药物外排泵或者细胞壁通透性机制可能参与上述菌株对氟喹诺酮类药物耐药；(3)可能还有新的耐药相关基因尚未被发现。

笔者认识到本研究的不足，由于目前仅对gyrA基因在MTB对氟喹诺酮类药物耐药中的作用机制相对明确，因此笔者仅通过对gyrA基因的测序来分析其不同突变类型与耐药的相关性，未考虑其他机制在氟喹诺酮类药物中的联合作用。全基因组测序技术为全面理解MTB耐药机制提供了重要工具，后续的深入研究将为全面理解靶基因突变、药物外排泵及细胞壁通透性等机制在对氟喹诺酮类药物耐药中的作用提供重要依据。

有研究提示，当MTB对某种抗结核药物产生低浓度耐药时，可以通过提高药物的剂量以达到治疗的目的[16]。作为治疗耐药结核病的重要核心药物，氟喹诺酮类药物日益受到人们的重视。本研究通过对gyrA不同突变类型的分析，预测患者对氟喹诺酮类药物的耐药水平，将为结核病患者提供更多备选药物，具有重要的临床价值，能够真正实现个体化诊断及精准医疗。

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(本文编辑：郭萌)

Analysis of the relationship between differentgyrAmutations and fluoroquinolone resistance levels inMycobacteriumtuberculosisisolates from China

ZHANGZhi-guo,DUChun-ying,ZHANGQian,WANGYu-feng,PANGYu,ZHAOYan-lin.

BeijingChangpingCenterforTuberculosisControl,Beijing102200,China

ZHAOYan-lin,Email:zhaoyanlin@chinatb.org

Objective To investigate the prevalence of genetic mutations located in thegyrAgene among fluoroquinolone (FQs)-resistantMycobacteriumtuberculosisisolates, and the relationship between different mutations and minimal inhibitory concentrations (MIC) against fluoroquinolones. Methods The national drug resistance baseline survey conducted in 2007 randomly enrolled 70 clusters from 31 provinces. A total of 4017M.tuberculosisstrains were collected, of which 138 were ofloxacin (Ofx)-resistant. All isolates were sequenced for genetic mutations ingyrAconferring FQ resistance. The broth dilution method was used to determine the MIC of these isolates against Ofx, levofloxacin (Lfx) and moxifloxacin (Mfx). Fisher’s exact test was performed to compare the high-level resistance rates of different FQs.P<0.05 was considered to be statistically significant. Results Of the 138 Ofx-resistantM.tuberculosisisolates, 90 (65.2%) isolates harboredgyrAmutations, the most frequent mutation being in codon 94 (34.8%，48/138). Strains with mutations in codons 88, 89 or 91 ofgyrAexhibited low-level FQ-resistance. Codon 94 mutations were diverse and were associated with different levels of FQ-resistance. When the mutation of codon 94 resulted in substitution of Asp by Asn, high-level Ofx-, Lfx- and Mfx-resistance was observed in 80.0% (8/10), 30.0% (3/10) and 100.0% (10/10) of the isolates, respectively. In addition, one strain harboring a substitution of this Asp by Cys exhibited high-level resistance to Ofx, Lfx and Mfx. In contrast, we found that strains harboring a substitution of this Asp by Ala had low-level FQ resistance; 91.7% (11/12), 100.0% (12/12) and 58.3% (7/12) of these isolates were resistant to low-levels of Ofx, Lfx and Mfx, respectively. Conclusion Mutation ofgyrAis the most important mechanism that confers FQ resistance in China. Strains with different types ofgyrAmutations are associated with different levels of FQ resistance.

Mycobacteriumtuberculosis; Fluoroquinolones; Ofloxacin; Geneotyper; Drug resistance; Bacterial

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.09.003

“十二五”国家科技重大专项(2013ZX0003-003)

102200 北京市昌平区结核病防治所(张治国、杜春英、张倩)；中国疾病预防控制中心结核病预防控制中心(王玉峰、逄宇、赵雁林)

赵雁林，Email：zhaoyanlin@chinatb.org

2016-07-08)