聚羟基丙烯酸和Van-clear替代传统试剂在FISH法检测宫颈hTERC基因中的应用比较

陈志强，王　莹，米贤军，陈　昂，黄华勇，钟守军，邓文同，刘超凡，徐秀梅，代新珍

(南方医科大学附属中山博爱医院病理科， 广东中山　528400)



·技术方法·

聚羟基丙烯酸和Van-clear替代传统试剂在FISH法检测宫颈hTERC基因中的应用比较

陈志强△，王莹，米贤军，陈昂，黄华勇，钟守军，邓文同，刘超凡，徐秀梅，代新珍

(南方医科大学附属中山博爱医院病理科， 广东中山528400)

[摘要]目的：观察环保固定液(聚羟基丙烯酸、环保透明脱蜡液Van-clear单独或联合)替代传统固定液[4%(体积分数)中性缓冲甲醛、传统透明脱蜡液二甲苯]应用于荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)法检测宫颈组织中人端粒酶核糖核酸组分(human telomerase RNA component，hTERC)基因扩增的差异。方法： 收集2013年3月到2015年4月于中山市博爱医院妇科住院部送检的255例宫颈组织标本，同一病变部位切取4个样本，分为4组，命名为A、B、C、D组:A组采用4%中性缓冲甲醛固定、二甲苯透明脱蜡制作切片；B组采用聚羟基丙烯酸固定、二甲苯透明脱蜡制作切片；C组采用4%中性缓冲甲醛固定、Van-clear透明脱蜡制作切片；D组采用聚羟基丙烯酸固定、Van-clear透明脱蜡制作切片。采用FISH技术检测4组宫颈标本中hTERC基因。结果： 在FISH法检测宫颈各级病变组织hTERC基因时，荧光显微镜下，A、B、C、D四组的组织轮廓和背景均清晰，探针定位准确，可见耀眼的红/绿荧光信号。B、C、D组与A组阳性率相比差异均无统计学意义(P>0.05)，且FISH结果符合率高。结论： 环保试剂聚羟基丙烯酸、Van-clear有潜在的可能单独或联合替代4%中性缓冲甲醛、二甲苯应用于FISH法检测宫颈hTERC基因。

[关键词]病理学，临床；组织固定；石蜡包埋；原位杂交，荧光；末端转移酶端粒RNA

临床疾病的诊断和相关的实验室病理研究越来越依赖于石蜡包埋的样品，而固定与透明、脱腊是制作石蜡包埋样品的重要步骤。众所周知，使用甲醛作为固定剂一直是组织病理学检查的传统做法，但甲醛具有致癌性[1-2]，甲醛固定组织可改变核酸与蛋白质，限制了分子诊断技术在石蜡包埋组织中的应用[3]，因此，寻找一个环保的固定液已迫在眉睫。欧洲的大学和生物技术公司将环保固定剂(非交联固定剂PaxGene)应用于可溶性有机化合物和生物大分子的形态快速保存[4]已取得了良好效果。在石蜡包埋的样品中，二甲苯传统上被大量用于组织处理和染色，但有研究显示二甲苯可对身体造成多种健康危害[5-9]，所以寻找一个更安全的替代品是十分必要的。Premalatha等[10]利用生物环保精制矿物油作为二甲苯替代品脱蜡，在苏木精和伊红染色获得了满意效果。张进华等[11]应用环保样本处理液制作石蜡切片，提取DNA进行荧光定量PCR扩增，并与常规方法制作的石蜡切片进行比较，结果证实环保样本处理液能较好地保存组织中的DNA。

多年来有关环保固定液、透明脱蜡液的国内外相关报告和文献报道已有不少，大部分都是应用于病理常规染色、冰冻切片染色以及免疫组织化学染色，鲜见环保固定液、透明脱蜡液应用于FISH法检测宫颈hTERC基因差异的报道。本研究应用环保试剂聚羟基丙烯酸、Van-clear单独或联合替代传统试剂4%(体积分数)中性缓冲甲醛、二甲苯，比较FISH法检测宫颈各级病变的人端粒酶核糖核酸组分(human telomerase RNA component，hTERC)基因扩增阳性率的差异，以获得环保固定、透明脱蜡液未来在临床应用的实验依据。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2013年3月至2015年4月中山市博爱医院妇科住院部送检的255例宫颈组织标本，患者年龄23.2～72.6岁，平均年龄(48.5±2.7)岁；经病理确诊，其中宫颈炎性患者55例，宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)Ⅰ级患者65例、CINⅡ级患者54例、CINⅢ级/原位癌患者51例，宫颈浸润癌患者30例；所有肿瘤患者术前均未接受化疗或放疗，同一病变部位切取4个样本，大小均为1.0 cm×0.5 cm×0.2 cm。根据固定、透明脱蜡液的不同分成A、B、C、D组，A组采用4%中性缓冲甲醛固定、二甲苯透明脱蜡制作切片，B组采用聚羟基丙烯酸固定、二甲苯透明脱蜡制作切片，C组采用4%中性缓冲甲醛固定、Van-clear透明脱蜡制作切片，D组采用聚羟基丙烯酸固定、Van-clear透明脱蜡制作切片。

1.2试剂与设备

聚羟基丙烯酸固定液购自广州市艾发生物医学技术工程有限公司，Van-clear环保透明脱蜡剂购自华烁科技股份有限公司葛店分公司。探针：hTERC基因探针由中国北京金菩嘉医疗科技有限公司提供，为TERC/CSP3 DNA探针。SAKURA Tissue Tek Vip-5全自动密闭式组织脱水机为日本樱花检验仪器株式会社生产；HistoStarTMEmbedding Workstation包埋机、ShandonTMFinesseTM325手动石蜡切片机为德国Thermo生产，切片厚度2～3 μm；S500-24荧光原位杂交仪为美国Thermobrit公司生产；蔡司荧光显微镜(Zeiss，德国荧光显微镜公司)配备相应的波长滤波器、CCD摄像机、图像采集和分析系统。研究中所用的聚羟基丙烯酸是单纯固定液，固定速度是1 mm/h，于10～30 ℃温度下保存。

1.3组织学分组

根据世界卫生组织2014年发布的宫颈上皮内病变新的分类体系，宫颈上皮肿瘤包括低级别/高级别鳞状上皮内病变(low- and high-grade intra-epithelial lesions，LSIL/HSIL)，新分类的LSIL包括原来的CINⅠ，HSIL包括原来的CINⅡ及CINⅢ/原位癌[12]。CINⅠ级(轻度非典型增生)：异型细胞局限于上皮层的下1/3区；CINⅡ级(中度非典型增生)：异型细胞占上皮层的1/3～2/3；CINⅢ级(重度非典型增生及原位癌)：异型细胞超过上皮层的2/3但还未累及上皮全层。一般重度非典型增生具有恶变危险，故可将重度非典型增生视为癌前病变；原位癌指癌细胞局限于上皮全层内，尚未突破基底膜、间质无浸润；浸润癌指癌细胞突破基底膜，间质有浸润。

1.4组织标本采集及制片

阴道镜下采集宫颈活体组织标本，分别经聚羟基丙烯酸或4%中性缓冲甲醛固定12 h以上，用Van-clear或二甲苯透明，梯度酒精脱水、石蜡浸蜡流程和时间按中华医学会病理学会病理技术相关规程在全自动组织脱水机中进行[13]，常规石蜡包埋，2～3 μm厚切片，裱片于防脱片载玻片上。

1.5FISH相关操作及结果判读

玻片预处理后放入56 ℃恒温箱烤片过夜。Van-clear或二甲苯脱蜡后，胃蛋白酶K消化8 min，室温下氯化钠柠檬酸钠缓冲液(sodium chloride-citric sodi，SSC)洗脱，体积分数为70%、85%和100%的乙醇梯度脱水固定，自然干燥。于暗室滴加杂交液，盖上盖玻片，橡皮胶封边，73 ℃变性5 min，42 ℃杂交过夜；移去盖玻片，温度46 ℃，玻片置于50%(体积分数)甲酰胺/(2×SSC)溶液10 min × 3，再置于2×SSC溶液中10 min，最后于2×SSC/0.1%(体积分数)NP40溶液中5 min，室温70%乙醇中漂洗3 min，干燥后滴加4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)封固，于荧光显微镜下观察。

FISH结果判定参考探针试剂盒说明和相关文献[14]。信号判定：TERC探针为橘红色信号，CSP3探针为亮绿色信号。CSP3探针所标荧光颜色与TERC位点不同，作为对照探针参与对TERC位点的检测。阈值判定：正常细胞绿、红信号均≤2个，异常细胞绿、红信号>2个。选取正常宫颈组织20例，每例随机观察100个细胞，统计异常TERC信号细胞数的百分比。异常阈值=平均数+3×标准差[15-16]，本实验阈值为7.29%，取整数7%。每例样本随机计数100个细胞核，若异常信号细胞数的检测值大于异常阈值，判定为阳性结果；小于异常阈值，判定为阴性结果；等于异常阈值，则加大观测样本细胞数目，以判断最后结果。

1.6统计学方法

采用SPSS 19.0完成统计分析，FISH结果阳性率的差异用配对χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。FISH结果的符合率定义为以A组实验诊断结果为参照，B、C、D组实验诊断结果与其符合情况。

2结果

2.1荧光显微镜下的大体情况

在荧光显微镜下，A、B、C、D四组的组织轮廓和背景均清晰，探针定位准确，可见深蓝色细胞核及耀眼的红/绿荧光信号(图1)，随病变程度加重，异常杂交信号数量明显增加，出现多种不同的异常杂交表现，说明异常扩增及多体细胞比例显著增加。

A, The cervicitis cells are thediploid ones, in which the numbers of both the red and green signals are less than or equal to 2; B, The amplified or polysomic cells are seldom seen in the tissue at CINⅠ level; C, The number of the amplified and polysomic cells have obviously increased in the tissue at CINⅡ level; D, The proportion of the abnormally amplified and polysomic cells has obviously increased in the tissue at CINⅢ level. E, It is proved to be the cervical invasive carcinoma.

图1hTERC基因DNA双色FISH图像：亮绿色为CSP3信号数，橘红色为hTERC信号数，蓝色为细胞核(×1 000)
Figure 1 Bicolor FISH image of hTERC genes in DNA, in which the green ones are the CSP3 signals, the red ones are hTERC
signals, and the blue ones are the cell nucleus (×1 000)

2.2hTERC基因阳性率

A、B、C、D组试剂制片，FISH法检测宫颈各级病变组织hTERC基因阳性率结果见表1，可见B、C、D组与A组hTERC基因阳性率差异均无统计学意义(P>0.05)， 且FISH结果符合率高，最小值为96.36%(表2)，说明新型环保试剂与传统试剂一致性好。

3讨论

宫颈癌是女性癌症死亡的第二大原因，一般经10年左右会从癌前病变发展为浸润性宫颈癌，因此，有效筛选癌前病变是非常重要的。近年来有研究发现，在宫颈非典型异常增生到宫颈癌转化的过程中，几乎所有的宫颈上皮细胞都会出现hTERC基因的异常扩增[17-19]。应用FISH技术检测宫颈细胞内的遗传信息有望应用于宫颈癌的诊断[20-21]，因此，利用FISH技术进行hTERC基因扩增不仅可作为宫颈癌的重要筛查手段，而且还可能是预测恶性CIN的重要指标。

价格低廉的甲醛与二甲苯依然是迄今为止保存组织标本、透明脱蜡最常用的试剂，但其刺激性、毒性、致癌性已经引起人们的重视。本研究中所用的环保型固定液聚羟基丙烯酸是由多羟基丙烯酸聚合而成，性质稳定，对人体无害；Van-clear是一种从桔皮或其他植物中提取的生物透明剂，不含芳香族化合物，性质稳定，是对人体无危害的有机溶剂。

甲醛固定组织的机制为醛基与氨基基团形成可逆的羟甲基衍生物和稳定的亚甲基桥，从而使甲醛和蛋白质发生广泛的交联，但甲醛固定过程中可以改变许多生物分子，包括核酸和蛋白质。聚羟基丙烯酸固定组织的机制可能是羟基和羧基基团发生可逆的酯化反应，与此同时羧基和氨基集团发生中和反应；前者生成稳定的酯化物、硬化组织，后者维系稳定的反应环境，从而使蛋白质凝固、生物大分子快速保存[22]。图1背景清晰、探针定位准确，说明聚羟基丙烯酸固定组织效果良好，但较甲醛而言，因聚羟基丙烯酸固定过程中没有改变核酸和蛋白质，对核酸蛋白质的检出率可能更高。

透明脱蜡的主要作用机制是遵循相似相溶规律，通常的说法是“极性相似的两者互溶度大”，即分子间作用力的类型和大小相近的物质往往可以互溶。石蜡主要组分为直链烷烃，还有少量带个别支链的烷烃和带长侧链的单环环烷烃。二甲苯是苯环上两个氢被甲基取代的芳香烃。Van-clear是由C8～C12的饱和直链烷烃组合的混合物构成。从图1可知，两种透明脱蜡液的实际效果均良好，但与二甲苯相比，Van-clear的直链烷烃与石蜡组织结构更为相似，因此，其与石蜡的分子间结合得更紧密，更易互溶，为FISH法检测宫颈hTERC基因中探针的进入提供了更为有利的条件。

本研究选用环保试剂聚羟基丙烯酸、Van-clear环保透明脱蜡剂单独或联合替代传统试剂4%中性缓冲甲醛、二甲苯制作切片。从表1实验数据来看，4组hTERC基因扩增阳性率均与宫颈疾病的严重程度显著相关，且炎症、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ/原位癌、宫颈浸润癌的阳性率与梅平等[23]报道基本上一致。时姗姗等[24]利用Van-clear透明脱蜡液代替二甲苯用于分子病理检测，结果证实环保透明脱蜡液能较好地保存组织中的DNA，且对FISH法检测DNA结果无明显影响，与本文检测出的A组和C组hTERC基因阳性率无统计学差异这一结论相符。时姗姗等[24]研究的是5例乳腺癌HER2基因及5例肺癌EGFR基因，而本研究针对宫颈hTERC基因，且囊括了不同程度的宫颈病变，实验样本量更大。此外，本研究还对不同试剂制作切片后FISH检测hTERC基因的阳性率差异做了统计学分析，从多角度保证了研究的严谨性与可信度。

表1　4组FISH法检测宫颈各级病变组织hTERC基因的阳性率

Group A used 4% neutral buffered formalin fixed and xylene dewaxing; Group B used poly hydroxy acrylic fixed and xylene dewaxing;Group C used 4% neutral buffered formalin fixed and Van-clear transparent dewaxing to make slices; Group D used poly hydroxy acrylic fixed and Van-clear transparent dewaxing. CIN, cervical intraepithelial neoplasia.

表2　B、C、D组与A组FISH结果符合率

The abbreviations and groupings are shown in Table 1.

本研究以当前病理学界广泛使用的传统试剂(4%中性缓冲甲醛固定、二甲苯透明脱蜡)制作切片作为参考，应用于FISH法检测不同宫颈病变组织hTERC基因，结果表明，不论哪种宫颈病变，B、C、D组与传统试剂间hTERC基因阳性率差异均无统计学意义(表1)，且FISH检测结果符合率高(表2)，说明环保固定液、透明脱蜡液可以单独与传统透明脱蜡液、固定液搭配使用，也可联合使用，均不影响应用FISH技术进行hTERC基因扩增的检测。

环保固定液、透明脱蜡液单独或联合用于检测宫颈各级病变组织hTERC基因，其阳性率均不低于传统试剂组，从环保角度考虑，我们提倡联合使用环保固定液和环保透明脱蜡液。当然，本研究并未考虑假阳性问题，进一步的实验可以考虑对同一标本采用不同试剂进行hTERC基因阳性率检测，或者通过多次重复性实验排除手工操作存在差异的可能，以还原实验的真实结果，效果会更佳。

总之，对于日益发展的临床病理诊断和病理实验研究来说，在相关技术中用多病种、大样本去优化环保试剂的相关检测流程，将会是大势所趋。

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(2015-08-09收稿)

(本文编辑：赵波)

Comparison between poly hydroxy acrylic acid and Van-clear replacing the tradi-tional reagents to detect the cervicalhTERCgenes by adopting FISH technique

CHEN Zhi-qiang△, WANG Ying, MI Xian-jun, CHEN Ang, HUANG Hua-yong, ZHONG Shou-jun, DENG Wen-tong, LIU Chao-fan, XU Xiu-mei, DAI Xin-zhen

(Department of Pathology， Zhongshan BOAI Hospital Affiliated to Southern Medical University, Zhongshan 528400, Guangdong, China)

ABSTRACTObjective：To observe the difference of the human telomeres RNA component (hTERC) genes’ amplification in the cervical tissue by applying the environment-friendly fixative poly hydroxy acrylic acid and the transparent dewaxing solution Van-clear separately or jointly to replace the traditional fixative 4% (volume fraction) neutral buffered formalin and the conventional transparent dewaxing solution xylene in the use of fluorescence in situ hybridization (FISH) for detection. Methods: In the study, 255 cases of cervical tissue specimens submitted by the Department of Gynecology in Zhongshan Boai Hosipital were collected from Mar. 2013 to Apr. 2015. Four samples were taken from the same lesion site. All the cases were divided into 4 groups and named group A, B, C, and D. Group A used 4% neutral buffered formalin fixed and xylene dewaxing to make slices. Group B used poly hydroxy acrylic fixed and xylene dewaxing to make slices. Group C used 4% neutral buffered formalin fixed and Van-clear transparent to make slices. Group D used poly hydroxy acrylic fixed and Van-clear transparent dewaxing to make slices. The amplification of hTERC genes in the four groups of cervical specimens was also detected by FISH technique. Results: When the hTERC genes were detected by FISH method under the fluore-scence microscope, it was obvious that the tissue profile and the background of group A, B, C and D were all clear. The probe was fixed in the accurate position so that the bright red or green fluorescence signals were easily found in these four groups. Compared with the positive rate of group A, there was no statistical significance in that of group B, C and D (P>0.05). At the same time, the coincidence rate of the FISH results was high, which showed that the new environment-friendly reagent had no significant difference in the detection of cervical hTERC genes by FISH technique. Conclusion: It is possible for the environment-friendly reagent poly hydroxy acrylic acid and Van-clear to replace 4% neutral buffered formalin and xylene separately or jointly to detect the cervical hTERC genes by adopting FISH technique.

KEY WORDSPathology, clinical; Tissue fixation; Paraffin embedding; In situ hybridization, fluorescence; Telomerase RNA

doi:10.3969/j.issn.1671-167X.2016.02.033

[中图分类号]R365

[文献标志码]A

[文章编号]1671-167X(2016)02-0356-05

Corresponding author△’s e-mail, 765228687@qq.com

基金项目:中山市卫生局医学科研立项课题(2014J128)资助Supported by the Medical Science and Research Project of Zhongshan Municipal Health Bureau (2014J128)

网络出版时间：2016-3-2316：33：37网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.4691.R.20160323.1633.010.html