寡发酵链球菌在大鼠口腔内定植状态的观察

张　杰，宋　磊，段登辉，岳　林△

(1. 北京大学口腔医学院·口腔医院牙体牙髓科，北京　100081； 2. 中国科学院微生物研究所，北京　100101；　3. 北京大学口腔医学院·口腔医院综合科，北京　100081)



·论著·

寡发酵链球菌在大鼠口腔内定植状态的观察

张杰1，宋磊2，段登辉3，岳林1△

(1. 北京大学口腔医学院·口腔医院牙体牙髓科，北京100081； 2. 中国科学院微生物研究所，北京100101；3. 北京大学口腔医学院·口腔医院综合科，北京100081)

[摘要]目的：对寡发酵链球菌在大鼠口腔内高糖环境下的定植能力进行初步探索。方法：21天龄SPF-SD大鼠48只，24～27天喂以氨苄青霉素水溶液(内源性细菌抑制)，28天时将大鼠分为4组，每组12只，高糖持续饲喂，28～30天连续3天接种菌液，组1(SM组)接种变形链球菌菌液，组2(SO组)接种寡发酵链球菌菌液，组3(SO+SM混合接种组)接种变形链球菌和寡发酵链球菌混合菌液，组4为阴性对照组，不接种任何菌液。细菌接种次日和第10天，用无菌棉签擦取大鼠双侧下颌磨牙(6颗)牙合面、颊、舌面的菌斑，PBS系列稀释，SM组接种于MSB平皿和BHIS血平皿，SO组接种于MSAE平皿，SO+SM混合接种组接种于MSB平皿、MSAE平皿和BHIS血平皿，阴性对照组接种于MSB平皿和MSAE平皿。从MSB平皿筛选、计数变形链球菌，从MSAE平皿筛选寡发酵链球菌疑似菌落并16S rDNA测序鉴定寡发酵链球菌。结果：SO组接种寡发酵链球菌次日，寡发酵链球菌检出率为33.3% (4/12)；SO+SM混合接种组接种次日寡发酵链球菌检出率为0，而变形链球菌检出率为100.00%，变形链球菌占总菌的比例为14.70%±4.53%；SM组在接种次日的变形链球菌检出率也为100.00%，其占总菌的比例为12.42%±4.27%，与SO+SM混合接种组相比差异无统计学意义。SO组接种寡发酵链球菌第10天，寡发酵链球菌检出率为0；SO+SM混合接种组接种第10天，寡发酵链球菌检出率亦为0，而变形链球菌检出率为100.00%，变形链球菌占总菌的比例为15.78%±5.10%；SM组在接种第10天的变形链球菌检出率也为100%，其占总菌的比例为17.08%±5.75%，与SO+SM混合接种组相比差异无统计学意义。结论：本实验条件下，在大鼠口腔内高糖环境下，寡发酵链球菌在大鼠口腔内呈一过性显现，不能定植。

[关键词]寡发酵链球菌;链球菌，变异；大鼠，Sprague-Dawley

寡发酵链球菌(Streptococcusoligofermentans，以下简称SO)是2003年从健康人牙菌斑中分离到的一株新的口腔链球菌[1]，主要分布于人健康牙面牙菌斑，SO的检出和变形链球菌(Streptococcusmutans，以下简称SM)的数量之间似乎呈现一定的负性关系[2]。人们对其进行了系列体外研究，发现SO有较强的黏附能力、较弱的产酸和耐酸能力[2-3]，但上述结果多基于体外研究，不能模拟体内口腔菌斑生物膜的复杂性，也没有考虑宿主因素对SO的影响。更令人感兴趣的是SO在体内的生存状况，而SO是否能够定植是体内研究的前提和基础，因此本研究的目的是对SO在大鼠口腔内的定植能力进行初步探索。

1材料与方法

1.1细菌及培养条件

SM NCTC 10449T和SO LMG21535T(北京大学口腔医学院微生物实验室保存)于-70 ℃，50%(体积分数)甘油中冻存。将冻存的两种细菌在脑心浸液(brain heart infusion，BHI)琼脂培养基上活化，95%(体积分数)N2，5%(体积分数)CO2，37 ℃培养48 h后挑取单菌落，接种于BHI培养液中，37 ℃恒温培养至对数生长后期，用BHI培养液将菌悬液调至光密度值D600 nm=2.0[4]，备用。

1.2实验大鼠准备

本实验由北京大学生物医学伦理委员会实验动物福利伦理分会批准，在北京大学口腔医院实验动物中心SPF屏障系统内完成。

选用同一天出生的21天龄SPF-SD大鼠48只(维通利华公司提供)，21天断奶，编号并称记体重，持续喂以2000#饲料(高糖饮食)[5]，饮用5%(质量分数)蔗糖水溶液。

1.3内源性细菌抑制

第25～27天，连续3天饮用含200 mg/L氨苄青霉素(华北制药股份有限公司)的饮用水。第28天以无菌干棉签涂擦大鼠双侧下颌磨牙(6颗)牙合面、颊、舌面取菌斑，PBS系列稀释，接种于SM选择性培养基：轻唾杆菌肽琼脂平皿(mitis salivarius agar supplemented with bacitracin, MSB)[6]和SO选择性培养基：添加有终浓度为15 mg/L红霉素的轻唾琼脂平皿(mitis salivarius agar with erythromycin, MSAE)[7]，95% N2、5% CO2、37 ℃培养48 h检测内源性细菌抑制情况。

1.4细菌接种、培养

第28天停用氨苄青霉素饮用水，喂以5%蔗糖水溶液，48只大鼠随机分为4组，每组12只。28～30天，连续3天以无菌棉签蘸取准备好的菌悬液(1 mL)多次涂擦大鼠下颌磨牙(6颗)牙合面、颊、舌面接种细菌，至1 mL菌悬液用尽。组1(SM组)接种变形链球菌菌液，组2(SO组)接种寡发酵链球菌菌液，组3(SO+SM混合接种组)接种变形链球菌和寡发酵链球菌等量混合菌液，组4为阴性对照组，不接种任何菌液。

细菌接种后次日和第10天用无菌棉签涂擦大鼠双侧下颌磨牙(6颗)牙合面、颊、舌面2次获得菌斑，经PBS系列稀释，SM组接种于SM的选择性培养基MSB平皿和计数总菌的加有5%(体积分数)羊血的脑心浸液血琼脂平皿(brain heart infusion agar supplemented with 5% defibrinated sheep blood, BHIS)，SO组接种于SO的选择性培养基MSAE平皿，SO+SM组同时接种于MSB平皿、MSAE平皿和BHIS血平皿，阴性对照组同时接种于MSB平皿和MSAE平皿，95% N2、5% CO2、37 ℃培养48 h。

1.5SM的筛选、计数和鉴定

从菌落数为30～300个的MSB平皿上根据SM的典型菌落形态(菌落直径约1.0～1.5 mm，圆形，奶黄色隆起，表面似肉芽肿或霜玻璃样，质地坚硬，嵌入琼脂，在菌落顶部或周围常见水滴样或黏液样的葡聚糖产物)筛选、计数SM，SM菌量(CFU/mL)=菌落数×稀释倍数。从30～300个菌落的BHIS血平皿上计数总菌的数量(CFU/mL)，SM的数量以SM占总菌的比例表示，SM占总菌的比例=SM数量(CFU/mL)/相应样本的总菌数量(CFU/mL)×100%。

1.6SO的筛选和鉴定

根据张杰等[7]建立的方法并加以改进，从菌落数为30～300个的MSAE平皿上根据SO的典型菌落形态(菌落直径为0.5～1.0 mm，乳白色，突出于培养基表面，质地黏、软)筛选SO疑似菌落，1 mL BHI液体培养基培养增菌，革兰氏染色，在显微镜下(Olympus，日本)观察，根据SO典型菌体形态(革兰氏染色阳性，不规则短链状排列)进一步筛选SO疑似菌落。

用离心柱型细菌基因组DNA快速提取试剂盒(百泰克公司)提取疑似寡发酵链球菌菌株的DNA。使用细菌16S rDNA通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCATGGCTCAG-3′)和1541R(5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成[8]，扩增疑似菌株的16S rDNA，片段长度为1 514 bp。25 μL PCR反应体系中含：1 μL DNA，引物27F和1541R各1 μL，dNTP 1 μL，10×buffer 2.5 μL，Taq DNA聚合酶0.1 μL和ddH2O 18.5 μL。95 ℃预变性6 min后，进行下述30个循环：94 ℃变性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，最后72 ℃保温10 min。所用仪器为Thermolyne公司AmplitronⅠ型PCR仪。将疑似菌落16S rDNA的扩增产物送北京诺赛基因组研究中心有限公司测序，将测定的序列提交GenBank，用Blast程序寻找同源性最高的16S rDNA序列，以确定疑似菌落是否是SO。

1.7统计学分析

应用SPSS 11.0统计软件，用非参数检验比较：SM单独接种和混合接种时，接种后次日SM的数量；SM单独接种和混合接种时，接种后第10天SM的数量。用符号秩和检验(Wilcoxon法)比较：SM单独接种时，接种次日和第10天SM的数量；SM和SO混合接种时，接种次日和第10天SM的数量。检验水准为双侧α=0.05。

2结果

2.1内源性细菌抑制情况

全部大鼠饮用含有氨苄青霉素的饮用水后菌斑中未检出SM和SO。

2.2阴性对照组细菌检出情况

全部大鼠在两个时点的菌斑样本经鉴定均没有检出SM和SO。

2.3SM单独接种时检出情况

SM组在接种后次日，SM检出率为100.00%，占总菌的比例是12.42%±4.27%；接种后第10天，SM检出率仍为100.00%，占总菌的比例是17.08%±5.75%。SM单独接种时在接种后次日和接种后第10天占总菌的比例差异无统计学意义(P=0.071)。

2.4SO单独接种时检出情况

SO组接种后次日，经镜检和16S rDNA测序鉴定，4只大鼠口腔内可检出SO，检出率为33.3%。接种后第10天，SO检出率为0。

2.5SO和SM等量混合接种时细菌检出情况

SO+SM混合接种组接种次日和第10天，SO检出率均为0，SM检出率均为100.00%。接种次日，SM占总菌的比例为14.70%±4.53%，与单独接种时(12.42%±4.27%)相比差异无统计学意义(U=57.000,P=0.386)；接种第10天，SM占总菌的比例为15.78%±5.10%，与单独接种时(17.08%±5.75%)相比差异无统计学意义(U=64.000,P=0.644)；SM占总菌的比例在接种次日(14.70%±4.53%)和接种第10天(15.78%±5.10%)相比差异无统计学意义(P=0.583)。

3讨论

3.1细菌接种近期的SO生存状态

本研究中，SO组接种次日，12只大鼠中有4只检出了SO，检出率为33.3%。Zhang等[2]的研究结果显示，18人中有7人的牙面菌斑可检出SO，检出率是38%，两研究的检出率相似。从体外对SO生物学特性的研究结果可以看出，该细菌在体外表现出较强的黏附能力，对光滑硬玻璃板的附着略强于戈登链球菌(Streptococcusgordonii)，但明显弱于SM[2]；合成细胞外多糖尤其是不溶于水的多糖的能力较差，明显弱于SM。由此可见，SO具备附着于牙齿表面的条件，但附着的能力并不很强。与体外实验不同，大鼠口腔是一个多种细菌共存的微生态环境，SO在这种复杂的环境中是否能够定植和生存受到许多因素的影响，细菌间的相互作用被视为决定性因素[9]。细菌间的相互作用包括协同作用和拮抗作用，拮抗作用可以通过细菌间竞争空间位点、竞争营养物质及产生拮抗物质(如细菌素、有机酸过氧化氢等物质)来抑制其他细菌的附着、生长[10]。本研究采用的大鼠是SPF级动物，口腔内有常驻菌存在，它是否对SO的附着和定植有影响尚待研究。

SO+SM混合接种组接种次日SO的检出率为0，而SM检出率为100.00%，SM占总菌的比例为14.70%±4.53%。本研究所设SM组在接种次日的SM检出率也为100.00%，其占总菌的比例为12.42%±4.27%，与SO+SM混合接种组相比无显著差异。本研究结果显示，SO在与等量SM同时接种于高糖饲喂产生的低pH口腔环境条件中时，SO并不能附着生长，而SM却如单独接种时一样在此环境条件下生长。Tong等[11]在体外胰胨酵母精葡萄糖琼脂培养皿上同时将SO和SM进行邻近接种培养，结果显示SO抑制了SM的生长，并且认为这种抑制作用是通过产生过氧化氢实现的。分析本研究结果与上述体外研究结果不同的原因可能是：(1)体外研究在培养皿上进行，SO和SM分别有各自的生长空间和营养物质，SO和SM都能生长并分别产生自己的代谢产物达到相互对抗的效果；但在体内不同，口腔内的生物膜具有高密度和微生物多样性的特点，空间、营养等资源有限，需要通过竞争获得，而SO的黏附能力，耐酸能力[2-3]，合成细胞外多糖尤其是不溶于水的多糖能力明显弱于SM，两者同时接种时SO处于弱势，在和SM竞争附着位点、营养物质时难以胜出，故难以在牙齿表面附着和生长。(2)体外试验中，SO对SM的抑制是通过过氧化氢实现的，过氧化氢的产生是氧气依赖型的，一旦菌斑到达一定的厚度，细菌到达一定的密度，由于扩散的有限性，氧气张力会降低，导致过氧化氢到达一个不能抑制SM的水平[12]。(3)SM可以通过产生变链素，像抑制其他口腔细菌一样[13]，干扰 SO在牙面的附着和生长，而且由于SM有较强的产酸能力[2]，可以在大鼠口腔内的高糖环境中大量产酸，进一步降低环境的pH值，从而彻底干扰了耐酸能力较弱的SO的附着和生长。

3.2细菌接种远期的SO生存状态

SO组接种SO第10天，12只大鼠无一检出SO，检出率为0；SO+SM混合接种组接种第10天，SO检出率亦为0；SO+SM混合接种组表现为与SM组同样的SM定植生长现象，提示在本实验的高糖环境下，SO不能定植。分析SO不能定植的原因为其黏附力、耐酸力均明显弱于SM，在低pH环境中生长受到明显的抑制[2-3]，而本研究对大鼠持续喂以高糖饮食和蔗糖水导致了大鼠口腔的低pH环境，随时间的延长低pH环境持续存在，从而导致SO的生长、繁殖和定植受到抑制，而这种环境却有利于SM定植生长。另外，由于目前对SO的认识尚有限，且口腔环境中营养物质、温度、pH、唾液的流速、氧气、细菌间的相互作用等都会影响细菌的定植，因此，在本实验条件下，可能有尚未了解的SO的生物学特性影响其定植。以往的研究也表明，并非所有分离自人类口腔的链球菌都能在口腔中定植，如口腔中的血链球菌虽然在菌斑形成过程中起重要作用，但它并不能定植[14]。不同的口腔链球菌在大鼠口腔内是否能够定植与细菌种的特异性有关，也与不同的饲养环境下动物口腔内获得的常驻口腔细菌有关[9]。

综上所述，本实验条件下，在大鼠口腔内高糖环境中，SO在大鼠口腔内一过性显现，不能定植，但本研究仅对SO在大鼠口腔内的定植状态进行了初步探索，需要有更多的研究来加深和拓展对SO定植能力的认识。

(志谢：感谢中国科学院微生物所的佟卉春副研究员和北京大学口腔医院实验动物中心的王大明老师在实验过程中给予的帮助。)

参考文献

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(2014-10-10收稿)

(本文编辑：任英慧)

Observation of oralStreptococcusoligofermentanscolonization in rats

ZHANG Jie1, SONG Lei2, DUAN Deng-hui3, YUE Lin1△

(1. Department of Cariology and Endodontology, Peking University School and Hospital of Stomatology, Beijing 100081, China; 2. Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China; 3. Department of General Dentistry, Peking University School and Hospital of Stomatology, Beijing 100081, China)

ABSTRACTObjective：To study the colonization ability of Streptococcus oligofermentans (S. oligofermentan) in the condition of high sucrose in oral cavity of rats. Methods: In this study, 48 SPF-SD rats aged 21 days were selected. From 24(th) to 27(th) days, the rats were fed with water of antibiotic and fed with high glucose diet continuously. On the 28(th) day, the rats were divided into four groups randomly, 12 rats per group. From the 28(th) day to 30(th) day, the first group (SM group) was inoculated with S. mutans, the second group (SO group) with S. oligofermentan, the third group (SO+SM group) with mixture of S. mutans and S. oligofermentan, the control group not with any bacteria. On the next day and the 10(th) day after inoculation of bacteria, the samples of dental plaque of the rats were acquired by scrubbing occlusal, buccal and lingual surfaces of bilateral mandibular molars with sterile swabs. The samples of SM group were inoculated on MSB and BHIS, of SO group on MSAE, of SO+SM group on MSB, MSAE and BHIS,of the control group on MSB and MSAE. S. mutans were screened and calculated on MSB, the suspected colonies of S. oligofermentan were screened and identified by the analysis of 16S rDNA. Results:On the next day, the detection rate of S. oligofermentan was 33.3% (4/12) in the group of SO; in the group of SO+SM, the detection rate of S. oligofermentan was 0, the detection rate of S. mutans 100.00%, and the proportion of S. mutans 14.70%±4.53%; in the group of SM, the detection rate of S. mutans was 100.00%, the proportion of S. mutans 12.42%±4.27%. On the 10(th) day, in the group of SO, the detection rate of S. oligofermentan was 0; in the group of SO+SM, the detection rate of S. oligofermentan was 0, the detection rate of S. mutans 100.00%, and the proportion of S. mutans 15.78%±5.10%; in the group of SM, the detection rate of S. mutans was 100.00%,and the proportion of S. mutans 17.08%±5.75%. Conclusion: In the condition of the experiment where high glucose was maintained in the oral cavity in rats, S. oligofermentan appeared transiently and couldn’t colonize in the rats.

KEY WORDSStreptococcus oligofermentans; Streptococcus mutans; Rats, Sprague-Dawley

doi:10.3969/j.issn.1671-167X.2016.02.025

[中图分类号]R378.12

[文献标志码]A

[文章编号]1671-167X(2016)02-0316-04

基金项目:北京大学口腔医学院青年科研基金(PKUSS20110111)资助 Supported by the Foundation of Peking University School of Stomatology (PKUSS20110111)

△ Corresponding author’s e-mail, kqlinyue@bjmu.edu.cn

网络出版时间：2015-10-1215：06：00网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.4691.R.20151012.1506.014.html