结核分枝杆菌38kDa蛋白结构与功能的生物信息学分析

张怡清　杨园园　丁淑琴

摘要：目的 应用生物信息学分析软件预测结核分枝杆菌38kDa蛋白氨基酸序列的结构与功能。方法 应用NCBI、Expasy等在线生物信息学网站及DNAstar、Rasmol等软件包分析38kDa蛋白与其他物种的同源序列，进行多序列同源比对；预测二级结构、三级结构；预测主要抗原表位等。结果 同源性比对结果表明结核分枝杆菌38kDa蛋白结核分枝杆菌磷酸盐转运蛋白同源性达87%；预测该蛋白的分子质量单位为39113.47 Da，理论等电点为11.779；该蛋白跨膜区有2个，分别为7-23，7-105，其结构域5个分别位于8-22、35-47、48-79、214-232、233-286。结论 生物信息学技术在结核分支杆菌38kDa蛋白研究中有一定的理论和应用价值。

关键词：结核分枝杆菌；38kDa；生物信息学；结构；功能

Bioinformatics Analysis for the Structure and Fuction of 38kDa Protein of Mycobacterium Tuberculosis

ZHANG Yi-qing1，YANG Yuan-yuan2，DING Shu-qin1

（1.Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，Ningxia，China；2.The First People's Hospital of Yinchuan，Yinchuan 750001，Ningxia，China）

Abstract：Objective To predict the structure and function of recombinant 38kDa of Mycobacterium tuberculosis using bioinformatics method . Methods By online analysis at bioinformatics websites such as NCBI and Expasy ，employing software packages such as DNAstar and Rasmolto do multi-sequence homological alignment， secondary structure and tertiary structure，antigenic epitope analysis，etc. Results Similarity of 38kDa of Mycobacterium tuberculos compared to phosphate-binding protein of Mycobacterium tuberculosis was 87% . Analysis of the predicted protein indicated a molecular mass of 39113.47 Da， PI was 11.779 ， two transmembrane region， function sites and eight antigen epitope were found . Conclusion Bioinformatic is valuable to the study 38kDa 6 ofMycobacterium tuberculosis.

Key words：Mycobacterium tuberculosis ； 38kDa ； Bioinformatics；Structure and fuction

结核病是全球卫生问题之一。2012年WHO的数据显示，全世界约有860万人罹患结核病，130万人死于结核病[1]。中国是全球22个结核病高负担国家之一，卫计委已将结核病列为全国重点控制重大疾病之一。及时有效的诊断对结核病的防治具有重要的意义。结核分枝杆菌诊断抗原的筛选是目前研究的热点。

38kDa 蛋白又名pab，是一种磷酸盐转运蛋白，是MTB分泌较多的抗原。研究表明其属于分泌蛋白，结核病患者体内抗38kDa 蛋白抗体水平较高[2]。38KDa 蛋白广泛用于结核病的血清学诊断试验，检测的敏感性和特异性均较高。有关报道38kDa 的诊断特异度在88%～100%之间，痰涂片阳性患者诊断灵敏度36%～89%，痰涂片阴性患者灵敏度16%～54%、肺外结核诊断灵敏度12%～56%[3]。Wu X[4]的研究成果表明：38KDa 蛋白诊断结核病的敏感性为73.6%，特异性为85.4%，并且发现PPD 阳性血清中的抗38KDa 抗体水平高于PPD 阴性。国内张萍等[5]研究重组38KDa 蛋白用于结核病血清学诊断，发现重组38KDa蛋白检测结核病的敏感性为65.5%，特异性为98.4%，且与痰检阳性的一致率为69.8%。38KDa 蛋白有较好的应用前景，重组38KDa 蛋白作为结核病皮试诊断试剂，其敏感性和特异性都优于目前的结核菌素试验。然而有关38KDa蛋白的基本理化特性、二级结构等的研究报道很少。本研究拟先对其进行生物信息学预测分析，为后续更好的的实验研究奠定基础。

1 资料与方法

1.1一般资料 结核分枝杆菌38kDa蛋白全长基因序列源自GenBank（Sequence ID： lcl|4289）。

1.2方法 通过NCBI网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），进入blast 界面，进行核酸和蛋白质的同源性比较。利用Prot Param（http：//ca.expasy.org/tools/protparam/html）预测蛋白质理化性质。通过PredictProtein （http： cubic.bioc. columbia. edu/predi ctprotein/）预测氨基酸序列的跨膜区，用DNAstar软件预测其二级结构。通过SMART（http： //smart. embl-heidelberg.de/smart/show-motifs.pl）预测其结构域。

2 结果

2.1氨基酸序列及理化特性预测 38kDa基因序列由1124个bp组成，编码368个氨基酸，其中50 个碱性氨基酸（K，R），13个酸性氨基酸 （D，E），112 个疏水性氨基酸 （A，I，L，F，W，V），106个 极性氨基酸（N，C，Q，S，T，，Y）。该蛋白的分子质量单位为39113.47 Da，理论等电点为11.779，碱性氨基酸残基（Arg+Lys）百分比为15.6%，酸性氨基酸残基（Asp+Glu）百分比为17.2%，在哺乳动物体外的半衰期为100h，在酵母、大肠埃希菌中的半衰期分别大于20h和10h，在溶液中的不稳定指数为60.32，脂溶性指数为62.72，两亲性指数为-0.436。

2.2氨基酸序列的同源性分析 如图1所示，38kDa基因氨基酸序列与结核分枝杆菌磷酸盐转运蛋白（Sequence ID： ref|WP_052645811.1|）同源性达87%。

图1 38kDa基因氨基酸序列的同源性分析

2.3二级结构预测 如图2所示，经DNAstar软件预测，38KDa蛋白的二级结构中α-螺旋占21%，β-片层占17%，转角占51%，无规则卷曲占11%。

图2 38kDa蛋白二级结构预测

2.4跨膜区域、结构域预测 跨膜区域如图3所示，该蛋白跨膜区有2个，分别为7-23，7-105，该蛋白主要位于细胞外，说明其为分泌性蛋白。SMART预测结果显示该蛋白的结构域有5个，分别位于8-22、35-47、48-79、214-232、233-286。

图3 38kDa蛋白跨膜区域预测

2.5信号肽预测 如图4所示，经Signal法预测显示38kDa蛋白的信号肽长为20个氨基酸残基，具体位于1-20，剪切位点位于20-21氨基酸残基之间。

图4 38 kDa蛋白信号肽预测

3 讨论

随着近年来生物学分子信息的发展，用较低的成本和较快的时间，通过计算机模拟相关的辅助信息可以获得大量的结构和功能信息。本研究中根据对38kDa蛋白氨基酸序列及理化特性预测，我们得知38kDa基因序列由1124个bp组成，编码368个氨基酸，其中50 个碱性氨基酸（K，R），13个酸性氨基酸 （D，E），112 个疏水性氨基酸 （A，I，L，F，W，V），106个 极性氨基酸（N，C，Q，S，T，，Y）。该蛋白的分子质量单位为39113.47 Da，理论等电点为11.779，碱性氨基酸残基（Arg+Lys）百分比为15.6%，酸性氨基酸残基（Asp+Glu）百分比为17.2%，在哺乳动物体外的半衰期为100h，在酵母、大肠埃希菌中的半衰期分别大于20h和10h，在溶液中的不稳定指数为60.32，脂溶性指数为62.72，两亲性指数为-0.436。氨基酸同源性比对发现其基因序列与Genbank公共数据库检索出的与结核分枝杆菌磷酸盐转运蛋白同源性达87%，说明结核分枝杆菌38kDa蛋白与磷酸盐转运蛋白有很高的同源性，但二者仍有差别[6]。经蛋白质二级结构分析， 该蛋白序列中α-螺旋占21%，β-片层占17%，转角占51%，无规则卷曲占11%。该蛋白跨膜区有2个，分别为7-23，7-105，该蛋白主要位于细胞外，说明其为分泌性蛋白。SMART预测结果显示该蛋白的结构域有5个，分别位于8-22、35-47、48-79、214-232、233-286。信号肽是一段连续的氨基酸序列，它能够控制蛋白质分泌路径和引导蛋白质到达特定的组织细胞[7]。研究信号肽问题对于了解蛋白质功能、研究疾病机理以及研制新药物等方面都有着重要的作用。本实验我们经Signal法预测结果显示38kDa蛋白的信号肽长为20个氨基酸残基，具体位于1～20，剪切位点位于20-21氨基酸残基之间。

本研究我们通过生物信息学原理对结核分枝杆菌38 kDa蛋白有了初步的了解和认识，至于该蛋白的获得及其在结核病诊断及治疗中的价值究竟有多大？还需后续的实验研究加以证实。

参考文献：

[1]Organization， W.H.Global tuberculosis control epidemiology，strategy， financing WHO report，2012.

[2]CHAN ED， HEIFETS I， ISEMAN MD. Immunogic diagnosis of tuberculosis： a review[J].Tubercle and Lung Disease， 2000， 80（3）： 131- 140.

[3]Julián E， Matas L， Alcaide J，et al. Comparison of antibody responses to a potential combination of specific glycolipids and proteins for test sensitivity improvement in tuberculosis serodiagnosis [J]. Clin Diagn Lab Immunol， 2004 ；11（1）：70-76.

[4]Wu X，Yang Y，Zhang J，et al.Humoral immune responses against the Mycobacterium tuberculosis 38-kilodalton， MTB48， and CFP-10/ESAT-6 antigens in tuberculosis[J]. Clin Vaccine Immunol， 2010，17（3）：372-375.

[5]Zhang Ping，Zeng Xiao-fan， Ding Jian-zhu， et al. Evaluation of thecell wall antigen and recombinant 38Kd protein of Mycobacterium

tuberculosis for serodiagnostic tests[J]. Chinese Journal of Microecology，2009，21（1）：73-74.

[6]丁淑琴，王洁，张焱.结核分枝杆菌phoS2基因的克隆及序列分析[J].宁夏医科大学学报，2010，32（6）：669-673.

[7]王 怡，郭躬德，孔祥增. 基于数据划分和集成的方法预测信号肽[J].计算机工程与应用，2012，48（36）238-244.

编辑/哈涛