凉血止痒合剂对变应性接触性皮炎小鼠IL—10和IFN—γ表达的影响

杨瑾 杨雪松

摘要：目的 研究凉血止痒合剂对变应性接触性皮炎小鼠IL-10和IFN-γ表达的影响。方法 通过凉血止痒合剂对采用2，4-二硝基氟苯（Dinitrofluobenzene 简称DNFB）造成变应性接触性皮炎（Allergic contact dermatitis 简称ACD）小鼠耳廓肿胀模型的影响，观察其对变应性接触性皮炎小鼠炎症细胞的抑制及对IL-10和IFN-γ表达的影响。结果 与模型组比较，凉血止痒合剂组能显著抑制炎症细胞浸润和提高小鼠血清IL-10水平，差异具有统计学意义（P<0.05）；但是对IFN-γ的产生无明显的影响（P>0.05）。结论 凉血止痒合剂对小鼠变态性接触性皮炎有效，促进抗炎因子IL-10 的产生和表达可能是其治疗机制之一。

关键词：凉血止痒合剂；变应性接触性皮炎；IL-10；IFN-γ；小鼠

中图分类号：R285 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2016）06-0071-03

【Abstract】Objective： To study the effect of Blood-cooling Antipruritic Mixture on IL-10 and IFN-γ expression of allergic contact dermatitis mice. Methods： Blood-cooling Antipruritic Mixture was used to affect 2，4 Dinitrofluobenzene-induced allergic contact dermatitis（ACD）ear swelling mice model and to observe the inhibition of allergic contact dermatitis mouse inflammatory cells and its effect on IL-10 and IFN-γ expression. Results： Compared with the model group，the Blood-cooling Antipruritic Mixture group could significantly inhibit the inflammatory cell infiltration and improve serum IL-10 level in mice. The difference was statistically significant（P<0.05），but IFN-γ generation had no obvious effect（P>0.05）. Conclusion： Blood-cooling Antipruritic Mixture has effect on mice allergic contact dermatitis，and the generation and expression of promoting anti-inflammatory cytokine IL-10 may be one of its therapeutic mechanisms.

【Key words】Blood-cooling Antipruritic Mixture，allergic contact dermatitis，IL-10，IFN-γ，mice

凉血止痒合剂是在本院皮肤科全国第三批名老中医学术经验继承工作指导老师、云南省名老中医刘复兴教授自创的皮内2号方—荆芩汤的基础上研发的中草药复方制剂（批号：滇药制字〈Z〉20081880A号，由云南省中医医院制剂室生产）。该方主要由荆芥、黄芩、生地黄、牡丹皮、赤芍、紫草6味药物组成，具有清热凉血、祛风止痒之功，临床主要用于治疗中医辨证属血热型的接触性皮炎、化妆品皮炎、特应性皮炎、光敏性皮炎等各种皮炎、湿疹及荨麻疹、药疹等多种变态反应性皮肤病[1]。凉血止痒合剂临床疗效显著，具有明显抗炎止痒的作用，且无明显毒副作用，然而其抗炎的作用机理，通过何种途径发挥作用，都尚不明确。本研究通过建立2，4-二硝基氟苯（DNFB）所致的小鼠耳廓肿胀模型，观察凉血止痒合剂对变应性接触性皮炎小鼠炎症细胞的抑制及对IL-10和IFN-γ表达的影响[2～3]，从组织病理及分子生物学方面阐述其作用机制，为其临床应用提供一定的理论及实验依据；同时通过急性毒性实验，观察凉血止痒合剂的毒副作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物 昆明种小白鼠，清洁级，40只，雌雄各半，体重18-22 g，合格证号：SCXK（滇）2005-0008；合格证号：0013106，由昆明医科大学实验动物中心提供。

1.1.2 药物 凉血止痒合剂（批号：滇药制字〈Z〉20081880A号），100mL/瓶，云南省中医医院院内制剂。醋酸地塞米松片（0.75mg/片，浙江仙琚制药股份公司，国药准字：H33020822，批号：130644）。0.9%氯化钠注射液（国药准字：H52020069，250mL/瓶，贵州天地药业有限责任公司出品，批号A13061504）。

1.2 主要试剂及仪器 小鼠IFN-γ ELISA 检测试剂盒、小鼠IL-10 ELISA 检测试剂盒（深圳晶美生物有限公司提供）；2，4-二硝基氟苯（DNFB）：武汉福鑫化工有限公司，批号：201206012，分析纯。显微镜、酶标仪，电子天平，电动剃毛器等。

1.3 给药剂量

1.3.1 凉血止痒合剂剂量 凉血止痒合剂生药含量为79 g/100mL，经人和动物的等效剂量系数换算，标准体重小鼠给药剂量为20.57 g/kg。

1.3.2 醋酸地塞米松片给药剂量[4] 小鼠给药剂量为0.01 g/kg。

1.3.3 急性毒性实验给药剂量 凉血止痒合剂分别一次给药剂量为200mg/kg。

1.3.4 主要试剂配制 以4∶[KG-*2]l的丙酮：橄榄油配成0.5%、0.2%两种浓度，现用现配。

2 实验方法

2.1 凉血止痒合剂对2，4-二硝基氟苯（DNFB）所致小鼠耳廓肿胀的影响

2.1.1 实验动物分组、给药与造模[4] 健康昆明种小鼠，30只，雌雄各半，随机（随机数字表法）分成3组，分别为模型组，阳性对照组（醋酸地塞米松组），凉血止痒合剂组。除模型组给予等体积生理盐水外，阳性药组醋酸地塞米松组每日给药量为0.01 g体重[4]，按照人和动物的等效剂量系数计算，标准体重小鼠给药剂量为20.57 g/kg，共给药7d。实验前一天在腹部固定部位3 cm×3 cm用剪刀及剃须刀去毛。实验第1、2天致敏期于去毛部位涂0.5%DNFB，每天1次，每次20 μL，第3、4、5天不涂药，第一次致敏后的第6天，用0.2%DNFB溶液20μl涂抹在小鼠左耳两面进行免疫攻击。右耳单涂丙酮∶橄榄油（4∶[KG-*2]1）溶剂作为对照；涂耳24 h后处死，沿耳廓基线剪下两耳。

2.1.2 观察指标

2.1.2.1 病理变化及炎症细胞计数[5] 处死小鼠后，耳部皮损组织用4%甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片，HE 常规染色，光学显微镜下观察各组病理变化，并用网型目镜测微尺计数单位面积真皮层最密集炎细胞浸润区的多形核细胞及单一核细胞数（个/mm2）。

2.1.2.2 检测血清IL-10、IFN-γ水平[5] 实验结束后，摘除小鼠眼球，眼眶内取血，抗凝血在4℃下3000 r/min离心30 min，获取血浆，利用ELISA检测血浆中IL-10、IFN-γ的浓度。

2.2 急性毒性试验

2.2.1 目的 观察凉血止痒合剂的毒副作用。

2.2.2 方法 取18～22 g小鼠20只，雌雄各半，分别一次给药凉血止痒合剂200 mg/kg，观察7d内动物死亡数，处死后解剖观察脏器有无病变。

2.3 统计方法 使用SPSS18.0统计软件。计量资料均使用（x±s）表示。两独立样本的计量资料比较若呈正态分布，并具有总体方差齐性，则采用t检验，若不具有总体方差齐性，则使用t检验。2组以上数据比较若具有总体方差齐性则采用单因素方差分析，多组数据间的两两比较使用Least-Signfieant-diffrne（LSD）方法；2组以上数据比较若不具有总体方差齐性，则使用Kruskal-Wallis H秩和检验，两两比较使用Mann-Whitney U秩和检验。以上统计方法，均以P<0.05为具有统计学意义。

3 实验结果

3.1 凉血止痒合剂对2，4-二硝基氟苯（DNFB）所致小鼠耳廓肿胀的影响，见表1，表2。

3.2 急性毒性试验 对照组和凉血止痒合剂组小鼠均存活，肝脏解剖未见明显异常，表明凉血止痒合剂无毒副作用，安全有效。

4 讨论

在炎症过程中产生的细胞因子可分为5类[1]：①调节淋巴细胞激活、增值、分化的细胞因子，如IL-2、IL-4、IL-10；②调节自然免疫的细胞因子，如TNF-α、IL-1β、IFN-α；③激活巨噬细胞的细胞因子，包括IFN-γ、TNF-α、TNF-β、IL-5、IL-10、IL-12；④对各种炎细胞的化学趋化因子；⑤刺激造血的细胞因子。其中IL-10是免疫反应的负调节因子，能减少LPS和IFN-γ诱导的单核/巨噬细胞释放IL-6、IL-8、TNF-α等前炎性细胞因子，促进抗炎介质如可溶性TNFR的释放，还可抑制CD4+T细胞的增值和细胞因子的分泌，包括Th1生成IL-2、IFN-γ和Th2生成IL-4、IL-5，同时还可抑制中性粒细胞合成和释放促炎介质[6]。IFN-γ属于激活巨噬细胞的细胞因子，可诱导加重炎症[1]。

凉血止痒合剂和醋酸地塞米松连续灌胃给药7天后，组织学检查显示凉血止痒合剂和地塞米松均可明显抑制小鼠右耳中单—核细胞、中性粒细胞浸润和充血水肿，2组与模型组比较有统计学差异（P<0.05），但凉血止痒合剂组和阳性对照组比较没有统计学差异（P>0.05），说明凉血止痒合剂与醋酸地塞米松片均具有抗炎的作用，但凉血止痒合剂的抗炎作用并不优于醋酸地塞米松。

在细胞因子IL-10的研究中，与模型对照组比较，阳性药地塞米松和凉血止痒合剂药物均显著提高具有免疫抑制活性细胞因子IL-10的产生水平，差异均有显著性意义（P<0.05），但阳性对照组与凉血止痒合剂组比较，差异不显著（P>0.05）；说明地塞米松和凉血止痒合剂均通过提高具有免疫抑制活性细胞因子IL-10的产生水平来达到抗炎的作用，但凉血止痒合剂并不优于醋酸地塞米松。对于IFN-γ的影响研究中，与模型对照组比较，阳性药地塞米松组IFN-γ产生显著减少，差异有显著性意义（P<0.01），然而凉血止痒合剂对小鼠细胞因子IFN-γ产生无明显的影响（P>0.05），说明地塞米松通过降低IFN-γ的水平，进而发挥抗炎症作用，但凉血止痒合剂对IFN-γ水平的影响不显著。

通过急性毒性试验，对照组和凉血止痒合剂组小鼠均存活，肝脏解剖未见明显异常，表明凉血止痒合剂无毒副作用，安全有效。

凉血止痒合剂临床应用已十多年，并在云南中医医疗集团20余家医院广泛使用，临床疗效显著，具有明显抗炎止痒的作用，且无明显毒副作用。现代药理学研究证明其组方中的黄芩、丹皮、赤芍、紫草、荆芥均有一定的抗炎作用，对I、II、III和Ⅳ变态反应均有抑制作用，对白介素、IFN-γ等细胞因子的表达水平均有影响[7～8]，为组方的合理性提供了一定现代药理学依据，但中药复方通常作用于机体多靶点、多环节，是个复杂系统，故有必要进一步深入研究，阐明其抗炎的作用机制，并通过急性毒性试验从科学角度验证其毒副作用。

通过以上的研究表明，凉血止痒合剂具有较为明确的抗炎作用，其抗炎作用可能与提高细胞因子IL-10的产生水平有关，且无毒副作用，安全有效。不仅为其它变态反应参与的皮肤病的防治开拓新的思路，同时为名老中医临床经验的应用推广提供了科学依据，为进一步挖掘及研究名老中医学术思想和临床经验提供了新的思路。

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（收稿日期：2016-03-28）