益气化瘀法对大鼠肛周脓肿术后创面组织中VEGF表达的影响

秦晓静 丁博文 刘学 蔡亮亮

摘要：目的 观察益气化瘀法对大鼠肛周脓肿术后创面愈合过程中VEGF表达的影响，进一步探讨益气化瘀法促进创面愈合的作用机制。方法 将 30只SD大鼠完全随机分为模型组（10只）、对照组（10只）、治疗组（10）只，于术后第7 d，取创面全层组织，通过免疫组化检测创面组织中 VEGF含量表达水平和血管数，并观察创面愈合时间。结果 治疗组大鼠创面组织中 VEGF含量表达水平显著增加，与对照组、模型组比较，差异有统计学意义（P<0.001）。治疗组创面愈合时间明显优于模型组和对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 益气化瘀法明显促进实验大鼠肛周脓肿术后创面的愈合，通过上调VEGF表达，促进血管的新生，加速创面的愈合。

关键词：血管内皮生长因子；益气化瘀；创面修复；肛周脓肿

中图分类号：R285 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2016）06-0068-03

【Abstract】Objective： To observe the effect of Tonifying Qi to Dispering Blood Stasis Method on VEGF expression in postoperative wound tissue of rat perianal abscess and further explore its mechanism to promote wound healing. Methods： 30 SD rats were randomly divided into a model group（10）and a control group（10）and a treatment group（10）. In the seventh day after surgery，the wound full tissue of the rats was taken and VEGF content expression and number of blood vessels in the wound tissue were detected by immunohistochemistry and wound healing time was observed. Results： VEGF expression level in the wound tissue of the treatment group significantly increased. Compared with the control group and the model group，the difference was statistically significant （P<0.001）. The healing time of the treatment group was quicker than that of the model group and the control group，and the difference was statistically significant（P<0.05）. Conclusion： Tonifying Qi to Dispering Blood Stasis Method significantly promotes the postoperative wound healing of the rat perianal abscess and also promotes the rebirth of vascular and accelerates wound healing by upregulating the expression of VEGF.

【Key words】vascular endothelial growth factor，Tonifying Qi to Dispering Blood Stasis Method，wound healing，perianal abscess

肛周脓肿是肛肠科常见疾病，手术为主要治疗手段[1～2]，但术后由于特殊的解剖结构，加之粪便污染、炎症刺激等因素，创面的修复一直是研究的热点问题。中医益气化瘀法对慢性难愈性创面的修复有着较好的临床疗效。本研究旨在观察根据益气化瘀法自制生肌扶正油纱对实验大鼠肛周脓肿术后感染创面的促愈作用，并通过观察血管内皮生长因子（vascular factor，VEGF）在大鼠肛周脓肿术后创面愈合过程中的表达变化，进一步探讨与阐明益气化瘀法在创面愈合过程中的作用与机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要试剂 石蜡（上海国药集团69018961）、甲醛（上海国药集团10010018）、二甲苯（上海国药集团10023418）、无水乙醇（上海国药集团10092680）、30%H2O2（上海国药集团10011218）、快捷型酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物（福州迈新生物技术有限公司KIT-5020）、DAB浓缩型试剂盒（北京索莱宝生物科技有限公司DA1010）、苏木素（BASO714094）、中性树脂（上海长岛生物技术有限公司G8590）、10%水合氯醛。

1.1.2 主要仪器及耗材 正置显微镜（OLYMPUS公司 CX41）、移液器（吉尔森P型移液器公司P2、P10、P20、P100、P200、P1000）、恒温烘箱（上海恒一科学仪器有限公司DHG-9023A）、石蜡切片机（徕克公司SQ2125）、摊片机（徕克公司PPTHK-21B）、IMS图象分析系统（上海哈灵生物科技有限公司）、数码相机（NIKON公司D5100）。

1.1.3 药物组成及制备 扶正生肌油纱条的制作方法：处方：黄芪500 g，党参500 g，当归500 g，乳香500 g，没药500 g，玄胡索300 g，黄柏300 g，珍珠300 g，冰片80 g；制法：以上九味分别粉碎成细粉，过筛，加食用植物油6000 g，浸渍5～7天，炸枯，去渣，滤过，炼至滴水成珠；将无菌纱布剪成2cm×3cm大小的纱条置于铝制容器内；将炼好的药液与适量的凡士林加热混匀后倒入上述容器内；然后进行高温高压消毒后即可使用。

1.2 实验动物与实验方法

1.2.1 实验动物及分组 动物来源清洁级SD（sprague-dawly）大鼠，雄性，体重250 g，由徐州医学院实验动物中心提供（批号：医动字第02-22-2号）。

1.2.2 动物模型 参照付小兵[3]及郑雪平等[4]制造污染创面愈合的动物模型方法，加以改进后，拟造肛周脓肿术后创面的动物模型。大鼠背部手术区域备皮，以10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉，碘伏常规消毒，剪去直径2.0 cm大小皮肤，破坏皮肤全层及皮下浅筋膜直至肌层，止血后在创面上滴加大肠埃希菌标准菌株（ATCC25922，由南京便诊生物科技有限公司提供）0.1mL（1麦氏单位）。七号丝线缝合创面，48 h后拆除缝线，见伤口有脓性分泌物者为造模成功，即造成类似于临床肛周脓肿术后的创面。以后每次治疗前30 min在创面上滴加大肠埃希菌0.1 mL。

1.2.3 随机分组 将造模后的30只大鼠，随机分为模型组、对照组和治疗组，每组各10只。

1.2.4 治疗方法 于术后第l天开始治疗，每天1次。治疗组：大鼠创面清洁消毒后，扶正生肌油纱覆盖创面；对照组：大鼠创面清洁消毒后，凡士林油纱覆盖创面；模型组：大鼠创面清洁消毒后不作任何其他处理。

1.2.5 标本采集 大鼠造模成功，采用不同方法的治疗后，于术后第7天时，腹腔注射麻醉后，于创面中心取约0.5 cm的肉芽组织，10%甲醛溶液固定标本。

1.2.6 检测指标及检测方法

1.2.6.1 创面愈合时间 观察30只大鼠从创面用药起到创面完全上皮化所需时间。

1.2.6.2 免疫组织化学法检测VEGF表达 将采集固定好的标本，于甲醛溶液中固定24h后脱水，石蜡包埋，切片。然后进行烤片和脱蜡、水化、抗原修复、阻断系列处理；一抗孵育：滴加一抗（选择最佳稀释比例），湿盒孵育，室温下放置1 h（或者4℃孵育过夜）。0.02M PBS冲洗3 min×3次。二抗孵育：滴加HRP标记广谱二抗，湿盒孵育，室温下放置20 min～30 min。0.02M PBS冲洗3 min×3次。显色：DAB染色，观察到切片有颜色改变时，立即用自来水洗去染色液。苏木素染色：苏木素复染3 min，1%盐酸酒精分化，显微镜下观察，控制染色程度。自来水冲洗10 min，放入65℃烘箱中烘干水分。透明和封片：将玻片置于二甲苯中透明3 min×2次，中性树胶封片，放入65℃烘箱中15 min。通过显微镜拍照，采集分析样本相关部位，计算阳性面积。

1.2.6.3 图像分析法分析微血管数 每张石蜡切片，随机选取肉芽数组织区域的2个视野，计数每个视野的新生微血管（有完整管腔）。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件进行处理，所有的结果均以（x±s）表示组间比较采用方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 创面愈合时间 见表1。

3 讨论

肛周脓肿术后创面的愈合一直是肛肠科医生致力解决的关键问题。术后换药技术与局部创面的愈合时间及肛门功能恢复程度密切相关，决定着其最终治愈的效果。中医学认为人是一整体，局部溃疡愈合，关系全身气血的运行。《医林改错》曰：“元气既虚，必不能达于血管，血管无气，必停留而瘀”气为血帅，正气虚损则无力推动血行，血行不畅，瘀血内生，瘀血不去，新血不生，正气无由恢复，则正气耗损亦剧。两者互为因果，形成恶性循环，导致创面难愈。故以益气化瘀之法，使得正气充沛，瘀血化除，气行则血行，经脉流畅，创面生长迅速。实验研究发现，益气化瘀之法能有效促进创面愈合。益气类中药能够影响创面的肉芽生长状态及创面微血管的密度，改善二者的关系，促进创而的愈合，从而印证了“补虚生肌”、“化瘀生肌”的学术理论[5]。张平等研究发现活血化瘀、去腐生肌中药能在创面愈合的炎症和肉芽组织形成期促进bFGF和Hyp的生成，而在重组期减少其生成。这样既能加速创面愈合，又能减少疤痕产生[6]。

创面愈合是一个动态的、复杂的过程，受多种因素的影响。一旦表皮和真皮的保护屏障被打破，伤口愈合的生理过程就立即进行。创面愈合涉及不同的凝血、炎症、增生和组织重塑的重叠阶段。肉芽组织形成是创面修复愈合的关键步骤之一，而肉芽组织的本质是大量的毛细血管和丰富的成纤维细胞。丰富的新生毛细血管数量和形态，能充实肉芽组织且改善创面微循环，为组织修复提供所必须的氧及丰富的营养物质，从而有利于创面愈合。在创伤愈合中血管的形成是至关重要的一步，血管形成伤口愈合和组织再生的重要环节，VEGF是血管内皮细胞的有丝分裂原，是血管形成的关键调控因素之一[7]，它能特异性地作用于血管内皮细胞，具有维持血管正常形态和完整性、提高血管通透性、促进血管生成等作用[8]，在创面愈合过程中发挥重要作用。

本科在益气化瘀法的指导下，自制了生肌扶正油纱，在长期的临床实践中印证了该油纱在肛周脓肿术后换药中，能明显促进创面的愈合，但缺乏有效的科学实验来阐明其作用机理。本实验通过实验大鼠模拟肛周脓肿术后感染创面，发现创面愈合时间明显缩短，观测VEGF在创面肉芽组织中的表达，结果显示扶正生肌油纱组阳性面积表达显著升高，血管数亦高于对照组和模型组，因此反应了益气化瘀中药能通过上调创面组织VEGF表达量，诱导血管新生，在一定程度上改善创面组织的缺血、缺氧状态，从而促进创面愈合。

本研究为临床上应用益气化瘀法中药治疗感染性难愈性创面提供了科学的实验依据。

参考文献：

[1]H.A.Formijne Jonkers，W.A.Draaisma，S.D.Wexner，et al.Evaluation and surgical treatment of rectal prolapse：an international survey，Colorectal Dis，2013（15）：115-119.

[2]L.Bordeianou，C.W.Hicks，A.M.Kaiser，et al.Rectal prolapse：an overview of clinical features，diagnosis，and patient-specific management strategies，J Gastrointest Surg，2014（18）：1059-1069.

[3]付小兵，孙同柱，盛志勇.几种用于创伤修复研究的动物模型[J].中华实验外科杂志，1999，16（5）：479-480.

[4]郑雪平，许慧琴，丁义江，等.复方珠黄霜对兔背部人粪污染创面愈合的实验研究[J].中国中西医结合外科杂志，2002，8（5）：361-364.

[5]张臻，阀华发.益气化瘀法中药对糖尿病大鼠肉芽增生期创TGF-β/ALK5/Smad2/3通路的影响[J].新中医，2015，47（6）：270-272.

[6]陈平，张自强，施展，等.生肌玉红膏促进大鼠背部创面愈合的实验研究[J].云南中医药杂志，2010，31（5）：58-59.

[7]Kwon MJ，An S，Choi S，et al.Effective healing of diabetic skin wounds by using nonviral gene therapy based on minicir-cle vascular endothelial growth factor DNA and a cationic den-drimer[J].J.Gene Med，2012，14（4）：272-278.

[8]王佳琪，王国栋，颜红柱，等.生长因子在创伤愈合中作用的研究[J].创伤外科杂志，2013，15（3）：281-283.

（收稿日期：2016-03-28）