“分解纤维素的微生物的分离”中相关问题探讨

徐海丽

【摘 要】结合高中生物选修教学实践，主要探讨了透明圈中心出现红色的的原因、两种刚果红染色法的优缺点比较以及选择培养基和鉴别培养基的具体作用。

【关键词】选修；刚果红染色法；透明圈；鉴别培养基

“分解纤维素的微生物的分离”是人教版高中生物选修一《生物技术实践》中专题2“微生物的培养与应用”的一个课题。学习本节内容之前，学生已经掌握了有关微生物的分离和培养的相关知识，通过对“分解纤维素的微生物的分离”的学习和实践探究，不仅能够进一步巩固理论知识，更能激发学生的学习兴趣、提高学生的生物科学素养。下面笔者对教学过程中一些困惑进行了初步探讨。

一、刚果红染色法

（1）透明圈中心为什么有红色的菌落

刚果红（CR）是一种染料，刚果红本身是棕红色粉末。溶于水呈黄红色；溶于醇呈橙色；极微溶于丙酮；澄清亮红色溶液。它可以和像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红就能够与纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素分解酶分解后，刚果红—纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。

纤维素属于天然高分子化合物，在自然界中分布最广，也是最重要的多糖。它们在无机酸存在下能完全水解，并得到D—葡萄糖。如果纤维素不完全水解，还会得到其他的多聚糖，这些多聚糖就会结合刚果红形成多元糖—刚果红红色复合物。菌丝吸收多聚糖—刚果红复合物，在菌体内将此复合物分解为可以利用的小分子物质，但是刚果红不能被利用就沉淀在细胞里面，因此显示红色。或者进入菌丝的刚果红与微生物体内的葡聚糖成分再次结合，形成多聚糖—刚果红复合物，使刚果红固定在细胞内，从而使菌落成红色。在透明圈中央出现红色菌落，是刚果红进入菌体的原因。

（2）两种刚果红染色法比较

方法一：先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应。

方法二：在倒平板使就加入刚果红。

细菌生长过程中如果初始没有色素，则细菌不会大量合成能够分解色素的物质，在方法一中，后加入的色素来不及被有关酶分解。而方法二，初始有色素，所以更容易出现颜色消退的现象，某些微生物能够缓慢的降解色素从而导致透明圈。这一过程需要一段时间的培养。

刚果红在筛选纤维素分解菌上的应用已经有超过20年的历史，具体哪种方法更适合，可以根据实际进行选择。

二、实验过程中的选择培养基和鉴别培养基

（1）选择培养基的作用是什么

在本实验中，两次使用了不同的培养基。先来看一下选择培养基配方：酵母膏中富含微生物生长所需要的必须氨基酸以及B族维生素、核苷酸、微量元素等，但是含量少，不足以作为碳源，所以该培养基还是以纤维素粉作为唯一的碳源，只有纤维素分解菌可以很好的生长，所以可以初步筛选出能够利用纤维素的微生物，且培养基没有加入琼脂，液体培养基可以增加纤维素分解菌的浓度， 以确保能够从样品中分离所需的微生物。此过程也称为富集培养。

（2）鉴别培养基中为什么加土豆汁

首先我们要知道：①微生物通过稀释涂布平板法要在培养基上繁殖成一个菌落才能够进行鉴定；②不同微生物基因组成不同，所含的酶系统也不一样，它们对碳源利用是有选择的而且有一定的顺序，一般淀粉最先被利用，待淀粉消耗完了才会利用纤维素。

土豆汁是一种天然的培养基，不仅含有淀粉，还有很多矿物质和多种维生素，营养丰富，有利于微生物的繁殖。微生物可以利用淀粉作为碳源，但是会使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应，出现比较模糊的透明圈。在鉴别培养之前，由于梯度稀释和涂布使得菌体的密度下降，在鉴别培养基中加入土豆汁可以让单个菌体发展到一定数量形成菌落。当然其他的一些分解淀粉的微生物也可以繁殖，但是由于土豆汁的含量太少，其他杂菌还没有形成菌落之前淀粉被消耗完了，不能形成菌落，只剩纤维素作为碳源了，最后只有纤维素分解菌能够继续利用纤维素繁殖成菌落。所以鉴别培养基加土豆汁是为了让纤维素分解菌更好的繁殖，以便形成菌落。

结合相关实验表明，该CMC-Na鉴别培养基也可以用秸秆纤维素粉培养基和滤纸片鉴别培养基代替，这两种培养基中纤维素含量高，且制作简单，同时产生的透明圈也清晰，筛选出的纤维素分解菌应用价值更高。