应用荧光聚合酶链式反应检测冷冻羊肉卷中羊肉的含量

顾文佳 徐琼 张奕南 张清平 曲勤凤

摘 要：目的：探索应用荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）法检测冷冻羊肉卷中羊肉含量。方法：以羊线粒体细胞色素B基因为羊特异性基因，线粒体12S rRNA为内参基因，应用ΔCt法对羊肉含量进行相对定量，并与称重法进行比较，分析基因拷贝数和羊肉脂肪含量对定量结果的影响。结果：荧光PCR法建立的标准曲线在羊肉含量为1%～100%时具有良好的线性关系（R2=0.990 1）。检测7 个市售冷冻羊肉卷样品，荧光PCR方法检测出的羊肉含量与称重法羊肉含量的相关系数为0.945 0（P<0.001），平均绝对差异为-11.0%，95%可信区间为（-7.4%，-14.6%）。基因拷贝数不同和羊肉脂肪含量不同对内参基因扩增Ct值影响没有统计学意义（P值分别为0.072和0.206）。结论：荧光PCR法可用于快速检测冷冻羊肉卷中羊肉成分的相对定量。

关键词：荧光定量聚合酶链式反应；定量检测；羊肉

Application of Real-Time Fluorescence Polymerase Chain Reaction （PCR） for Quantitative Detection of

Lamb in Frozen Lamb Rolls

GU Wenjia， XU Qiong， ZHANG Yinan， ZHANG Qingping， QU Qinfeng

（Shanghai Institute of Quality Inspection and Technical Research， Shanghai 200233， China）

Abstract： Objective： To establish a real-time PCR method for quantitative detection of lamb in frozen lamb rolls. Methods： The ovine mitochondrial cytochrome b gene （Cyt b） as species-specific primer and the mitochondrial 12S rRNA as endogenous control were selected to conduct relative quantification through ΔCt vs. lamb content （%）. The results obtained were compared with those from the weighing method. Some factors that may affect the quantitative results including the number of gene copies and fat content in lamb were also analyzed. Results： A high correlation coefficient （R2 = 0.990 1） was showed between ΔCt and lamb content in the range of 1%–100%. The correlation between the results of real-time PCR and weighting method for seven marketed samples of frozen lamb rolls was statistically significant （R2 = 0.945， P < 0.001）， and the average absolute difference was ?11.0% （with a 95% confidence interval of ?7.4% to ?14.6%）. The effects of the number of gene copies and fat content in lamb on the quantitative detection were not statistically significant （P = 0.072， and P = 0.206， respectively）. Conclusion： The real-time PCR method can be used as a quick and practical method in quantitative detection of lamb in frozen lamb rolls.

Key words： real-time polymerase chain reaction； quantitative detection； lamb

DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.07.006

中图分类号：TS251. 7 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2016）07-0026-04

引文格式：

顾文佳， 徐琼， 张奕南， 等. 应用荧光聚合酶链式反应检测冷冻羊肉卷中羊肉的含量[J]. 肉类研究， 2016， 30（7）： 26-29. DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.07.006. http：//rlyj.cbpt.cnki.net

GU Wenjia， XU Qiong， ZHANG Yinan， et al. Application of real-time fluorescence polymerase chain reaction （pcr） for quantitative detection of lamb in frozen lamb rolls[J]. Meat Research， 2016， 30（7）： 26-29. （in Chinese with English abstract） DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.07.006. http：//rlyj.cbpt.cnki.net

羊肉中夹杂其他肉类的“混合羊肉卷”在市场中出售不但存在以次充好的问题，还因混杂来源不明肉类存在重大的安全隐患[1-2]。常见的混杂方式是羊肉中混合鸭肉或猪肉，加入羊尾油，添上羊肋骨间的脂肪，冻成肉柱，作为冷冻羊肉卷出售。虽然一些掺假的羊肉被压紧切片后，肥瘦相间的部位红白分明、界限清晰，而真羊肉的肌间脂肪纹路搭配自然合理，相互渗透，以此作为真假羊肉卷鉴别的依据，尚缺乏客观、定量的标准。

在肉类掺假鉴别方法中，最常见的方法为核酸分析法，包括聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）[3-4]、限制性片段长度多态性PCR（PCR-fragment length polymorphism，PCR-RFLP）分析[5-6]、测序法等[7-8]。荧光定量PCR方法灵敏、快捷，被广泛用于肉类成分鉴别研究中，并已作为标准方法在国内外推广[9-11]。当检测目标肉制品中含有其他物种时，荧光PCR法能够快速直接给出定性结果[12-15]；但是进一步定量检测混合肉制品中某种肉含量时，情况则复杂得多。尽管荧光PCR方法的定量结果影响因素很多，但因其方法灵敏、迅速，受到许多国内外学者青睐，研究探讨将其用于掺假肉制品定量检测的灵敏性和准确性[16-17]。

本研究应用荧光PCR方法推测冷冻羊肉卷中羊肉成分的质量比，通过与称重法比较，验证该方法的准确性和可行性，并对基因拷贝数和羊肉脂肪含量等影响定量结果的因素进行分析，为推广荧光PCR方法定量检测羊肉成分提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验用羊肉、鸭肉、猪肉为本实验室收集样品，冷冻羊肉卷购自批发市场，样品经解冻后称质量、取样。

DNA提取试剂盒（11796828001） 罗氏公司；PCR预混液Premix Ex Taq?（RR390） 大连宝生物工程有限公司。

1.2 仪器与设备

7500fast荧光定量PCR仪 美国ABI公司；6870冷冻研磨机 美国SPEX Sample Prep公司；6131生物分光光度计、5415R离心机 德国Eppendorf公司；AL204分析天平（感量0.1 mg） 瑞士Mettle-Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取

称取50 mg样品，按照试剂盒说明“组织中DNA的提取”进行。在50 mg组织中加入200 μL裂解液和20 μL蛋白酶K，55 ℃水浴1 h，加入200 μL结合液，混匀，70 ℃放置10 min，加入100 μL异丙醇，混匀，移入离心柱中，离心，洗涤2 次，用100 μL稀释液重悬DNA，4 ℃备用。

1.3.2 引物及探针

引物及探针由上海英俊生物技术服务有限公司合成，其序列见表1。

1.3.3 荧光定量PCR扩增体系及条件

荧光定量PCR反应体系为20 μL，包含DNA模板1 μL，Real Time PCR预混液10 μL，Rox 0.4 μL，上下游引物（10 mmol/L）各0.4 μL，探针（10 mmol/L）0.6 μL，以超纯水补足体积。

荧光定量PCR仪反应条件为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火35 s，40 个循环。使用ROX染料对荧光数值进行校正。

1.3.4 内校准系统的建立

选择线粒体基因12S rRNA作为内校准基因，分别称取相同质量的羊肉、鸭肉和猪肉各6 份，采取1.3.1节的方法进行DNA的提取，使用荧光定量PCR仪测定内参基因。比较所获得的Ct值之间的差异。

1.3.5 不同羊肉脂肪含量的比较

将羊肌肉组织与羊脂肪分别按照质量比3∶1、1∶1、1∶3混合，制成羊肌肉组织含量为25%、50%、75%和100%的4 份样品。按照1.3.1节的方法进行DNA的提取，使用荧光定量PCR仪测定羊特异性基因和内参基因，比较4 组之间Ct值的差异。

1.3.6 标准曲线的建立[19]

将新鲜羊肌肉组织和鸭肌肉组织按比例充分混匀，制成羊肉质量百分比分别为100%、50%、20%、10%、5%和1%的羊-鸭混合肉标准品，每组4 个平行，采取1.3.1节的方法进行DNA的提取，使用荧光定量PCR仪分别测定羊特异性基因（细胞色素B（cytochrome b，Cytb））和内参基因（12S rRNA）。根据所获得的Ct值，按照式（1）计算。

ΔCt=CtCytb-Ct12S rRNA （1）

以ΔCt为纵坐标，标准品中羊肉百分比的对数值为横坐标建立标准曲线。

1.3.7 市售样品的称重法检测

冷冻羊肉卷完全解冻后，将所有可剥离的肉块单独标记，逐块称质量，冲洗表面的血水后从组织中间取样约50 mg，采取1.3.1节的方法进行DNA的提取，使用荧光定量PCR仪测定羊特异性基因，做出定性判定。羊肉卷中羊肉的质量百分比按式（2）计算。

（2）

1.3.8 市售样品的荧光PCR法检测

随机选取冷冻羊肉卷的不同部位，充分粉碎混合，提取DNA并PCR扩增后，将其荧光PCR扩增所得的ΔCt值带入1.3.6节的标准曲线，由此得出市售羊肉卷中羊肉成分质量百分比。并与称重法结果进行对比，验证定量方法的准确性。

2 结果与分析

2.1 内校准系统

本实验设计了双重荧光PCR反应，即在同一反应管内同时扩增目标基因和内参基因，根据两者Ct值之差得出起始DNA中模板浓度的差异，进而推断出不同动物的质量比。为了校准不同动物之间细胞大小、线粒体基因拷贝数不同，分别称取相同质量的羊肉、鸭肉和猪肉各6 份，提取DNA后调整模板DNA质量浓度至

50 ng/μL，得到内参基因Ct值为羊肉15.72±0.35、鸭肉15.96±0.48、猪肉16.24±0.49，各组之间差异无统计学意义（F=2.969，P=0.072）。且将DNA模板10 倍系列稀释后，以Ct值为纵轴，模板DNA稀释倍数为横轴得到的回归方程斜率接近。本次实验相同质量羊肉、鸭肉和猪肉之间内参基因表达无差异，可以用作后续双重荧光PCR的内参照。

2.2 羊肉脂肪的影响

将羊肌肉组织与羊腹部脂肪按一定比例混合，制成羊脂肪含量为0%、25%、50%、75%的4 份样品，提取DNA后调整模板DNA质量浓度至50 ng/μL，测定羊特异性基因和内参基因Ct值，结果如表2所示。各组之间差异无统计学意义（F=1.774，P=0.206）。

2.3 标准曲线的建立

将新鲜羊肌肉组织和鸭肌肉组织按比例充分混匀，制成羊肉质量百分比分别为100%、50%、20%、10%、5%和1%的羊-鸭混合肉标准品，使用荧光定量PCR仪分别测定羊特异性基因（Cytb）和内参基因（12S rRNA）。根据所获得的Ct值，按照公式计算ΔCt。以ΔCt为纵坐标，标准品中羊肉质量百分比的对数值为横坐标建立标准曲线，得到线性方程为y=-4.501 9x+9.458 8，R?=0.990 1。

2.4 市售冷冻羊肉卷的定量检测

将购入的掺假冷冻羊肉卷按照称重法和荧光PCR法同时检测羊肉含量，结果见表3。荧光PCR方法检测出的羊肉含量与称重法羊肉含量的相关系数为0.945 0，

P<0.001说明两者相关性极高。荧光PCR方法检测出的羊肉含量与称重法结果比较平均，绝对差异为-11.0%，95%可信区间为（-7.4%，-14.6%）。

3 讨 论

定量检测混合肉类中各组分的质量比一直是肉类检测中的一个难点[20]。荧光PCR方法灵敏、迅速，有许多研究探讨将其用于掺假肉制品定量检测的可行性。本研究通过荧光PCR法检测冷冻羊肉卷中羊肉成分质量比，得出市售冷冻羊肉卷中羊肉含量为8.5%～35.6%。并与称重法比较，发现2 种方法检测结果相关性较高（r=0.945 0，P<0.001），在实际工作中可作为一个快速、简便的肉类定量检测的方法。

在应用中，将定量PCR得到的DNA拷贝数直接换算成各个肉组分的质量比会受到一些因素的影响[20-21]。首先，不同动物的细胞大小、染色体倍数、基因组大小、拷贝数等不同，会影响定量结果[21-22]；其次，未知肉的组成不同也会影响定量结果，相同质量的不同组织中DNA含量从多到少依次为：肾、心、肝、肌肉、脑、皮[17]；再次，DNA的提取效率、PCR的扩增效率不同也会影响核酸定量的准确性[23]。建立含有内参照系统的荧光定量PCR体系能够尽可能地消除由DNA提取效率和PCR扩增效率引发的差异，从而得到更接近真实值的定量结果[24-25]。本研究使用了含有内参照系统的双重荧光PCR体系，经实验分析，相同质量的羊、猪和鸭肉经DNA提取和PCR扩增，不同基因拷贝数和羊肉脂肪含量对内参基因扩增Ct值影响没有统计学意义。因此该方法可得到较广泛的应用，样本中脂肪含量、混杂的不同肉类成分对羊肉的定量结果影响不大。

混合肉类定量结果在同一实验室、使用同一样本制作标准曲线和盲样时，定量结果通常非常准确[26-28]。当遇到实际样本或者成分更多的混合肉制品时，荧光PCR的定量结果与实际结果会有较大差异[4，29-30]。周彤等[4]通过含猪源性成分的模拟混合肉样检测，样品猪源性成分含量的回收率平均值为122.27%。K?ppel等[29]则发现经过荧光PCR得出的定量结果与真值之间的误差在±30%之内。本研究荧光PCR法检测得出的羊肉含量结果比称重法偏低，平均差异为-11.0%，95%可信区间为（-7.4%，

-14.6%），与上述学者研究结果接近。应用该方法进行羊肉卷中羊肉成分定量检测时结果更趋于保守，产生这种差异可能的原因有待进一步研究。相对而言，称重法在肉制品各个小组分能够轻松分离、总数不多的情况下使用，如冷冻羊肉卷、羊肉串等，也是一个值得尝试的有效而准确的方法。

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