嫩化时间对大口黑鲈半成品品质的影响

鉏晓艳 邹开封 叶丽秀 王俊 王伟琼 熊光权

摘 要：为改善淡水鱼加工和灭菌过程导致的肉质老化和嫩度下降问题，以大口黑鲈（鲈鱼）为研究对象，通过物性测定、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和扫描电镜系统考察复合嫩化剂（氯化钙1.2‰ 、复合磷酸盐1.2‰、木瓜蛋白酶1.8‰，均为质量分数）作用时间对鲈鱼半成品的嫩化效果。结果表明：用该嫩化剂嫩化鲈鱼半成品1.0～1.5 h，可显著降低鱼肉剪切力和硬度分别至（21.89±0.27） N和（111.98±3.46） g，提高鱼肉pH值和L*，并增加鱼肉肌原纤维小片化指数；上述指标均和对照组差异显著（P<0.05）。凝胶电泳结果显示，嫩化后鱼肉肌原纤维中分子质量38 kD的蛋白和原肌球蛋白发生降解，在约37 kD和28 kD处产生了新的蛋白条带。扫描电镜结果表明，嫩化后鱼肉组织变得蓬松、肌纤维间连接物消失、肌原纤维发生断裂。该复合嫩化剂效果良好，嫩化1.0～1.5 h可显著提升鱼肉半成品品质。

关键词：大口黑鲈；嫩化；质构特性；蛋白质电泳；扫描电镜

Effect of Tenderization Time on the Quality of Semi-Finished Products from Micropterus salmoides

ZU Xiaoyan1， ZOU Kaifeng2， YE Lixiu1， WANG Jun1， WANG Weiqiong1， XIONG Guangquan1，*

（1. Hubei Innovation Center of Agricultural Science and Technology， Institute for Farm Products Processing and Nuclear-Agricultural Technology， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064， China；

2. Qianjiang Longwan Aquatic Technology Service Center， Qianjiang 433139， China）

Abstract： To overcome the quality deterioration and tenderness decline of fresh water fish during processing and sterilization， the tenderization effect of a meat tenderizer consisting of 1.2‰ calcium chloride， 1.2‰ phosphate and

1.8‰ papain on semi-finished products from the largemouth bass Micropterus salmoides as a function of treatment time was evaluated by texture analysis， sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE） and scanning electron microscopy （SEM）. The results showed that after 1.0–1.5 h of tenderization， the shearing force and hardness of fish meat were significantly reduced to （21.89 ± 0.27） N and （111.98 ± 3.46） g， respectively with a simultaneous significant increase in pH， brightness （L*） and myofibril fragmentation index （P < 0.05）. SDS-PAGE showed that the myofibrillar protein with a molecular weight of 38 kD and tropomyosin were degraded， consequently forming new protein bands with molecular weight of about 37 and 28 kD. Under SEM， fluffy microstructures with disappeared connective tissues and broken myofibers were observed for tenderized bass meat. The tenderizer could significantly improve the quality of bass semi-finished products at tenderization time of 1.0–1.5 h.

Key words： Micropterus salmoides； tenderization； texture properties； protein electrophoresis； scanning electron microscopy

DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.07.001

中图分类号：TS254.4 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2016）07-0001-05

引文格式：

鉏晓艳， 邹开封， 叶丽秀， 等. 嫩化时间对大口黑鲈半成品品质的影响[J]. 肉类研究， 2016， 30（7）： 1-5. DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.07.001. http：//rlyj.cbpt.cnki.net

ZU Xiaoyan， ZOU Kaifeng， YE Lixiu， et al. Effect of tenderization time on the quality of semi-finished products from Micropterus salmoides[J]. Meat Research， 2016， 30（7）： 1-5. （in Chinese with English abstract） DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.07.001. http：//rlyj.cbpt.cnki.net

大口黑鲈（Micropterus salmoides），又名鲈鱼，隶属鲈形目黑鲈属，肉味鲜美、营养丰富、经济价值高，是名贵鱼类之一，也是淡水养殖的主要品种[1]。目前，鲈鱼调理品加工业发展迅速，但加工和灭菌过程会导致其肉质嫩度降低，口感下降，这在一定程度上限制了鲈鱼调理品的销售及加工业的发展。

受传统消费方式和观念的影响，淡水鱼加工中嫩化研究很少，相关研究集中在实现了大规模工业化生产的牛肉[2-4]、猪肉[5]和鱿鱼[6]制品上。目前使用的嫩化方法中磷酸盐、钙离子和蛋白酶受到较多关注[7-8]，但三者协同作用的嫩化效果研究，尤其对淡水鱼加工品肉质改善效果及其最适作用时间的研究尚未见报道。

嫩化剂使用时间对鱼肉加工品品质的影响至关重要，实验前期研究显示，复合嫩化剂（氯化钙1.2‰、复合磷酸盐1.2‰、木瓜蛋白酶1.8‰）对鱼肉嫩化效果明显[9]，但嫩化时间难以控制，时间过短肉品嫩度不够，时间过长肉品糜化口感下降。目前，多数研究将表征肉品嫩度的剪切力作为单一指标[5，7-8，10]进行嫩化剂和嫩化时间的筛选，出现理论结果与实际应用难以衔接的现象。因此，本实验以鲈鱼半成品为研究对象，系统研究复合嫩化剂（氯化钙1.2‰、复合磷酸盐1.2‰、木瓜蛋白酶1.8‰）作用时间对鲈鱼肉品除了剪切力指标，还有质构特性、肌原纤维蛋白降解及表面微观结构的影响，确定嫩化剂使用时间，建立改善鲈鱼调理品品质的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲈鱼、盐、味精购于武汉市武商量贩；木瓜蛋白酶（酶活力6 000 U/mg） 广西南宁庞博生物工程有限

公司；焦磷酸钠、聚磷酸钠、偏磷酸钠、氯化钙等均为食品级试剂 武汉泰晟生物科技有限公司；其他生化

试剂 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

CR-400色差仪 柯尼卡美能达株式会社；PB-10 pH计 德国赛多利斯科学仪器有限公司；CLM-3B肌肉嫩度仪 北京朋利驰科技有限公司；TA-XTPlus食品物性测试仪 英国Stable Micro System公司；DYY-I2电泳仪 北京六一仪器厂；QUANTA扫描电镜 美国FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

河鲈鱼→去头尾、腮、鳞、内脏→分块→腌制嫩化→

速冻→冷藏→解冻→汽烹→制样→指标测定

1.3.2 原料处理

选用鲈鱼背部肉，去鱼皮，剔除原料中鱼刺，清洗后沥干，切成3 cm×1 cm×1 cm的条块。用1%食盐和0.5%味精均匀涂抹鱼块，随机分成5 组，用嫩化剂（含氯化钙1.2‰、复合磷酸盐1.2‰及木瓜蛋白酶1.8‰）分别处理0、0.5、1.0、1.5、2.0 h后，-40 ℃速冻30 min，-20 ℃冷库冷藏12 h，解冻后汽烹3 min。冷却后制样、检测。

1.3.3 色差值及pH值测定

鱼肉亮度L*、红度a*、黄度b*用便捷式色差仪测定，色差仪在使用前用白板进行校准，对每一肉样平行测定5 次。鱼肉搅成肉泥后离心，取上清液，用便携式pH计分别测量pH值，每组5 个平行。

1.3.4 质构特性及剪切力测定

取2 cm高的肉样，汽烹3 min，冷却后用TA-XTPlus质构仪测定硬度、弹性、黏性、咀嚼性、回复力等。测定条件：探头P/36R，模式TPA，测试前速率2.0 mm/s，测试速率1.0 mm/s，测试后速率1.0 mm/s，强度75%[11]。每个样品平行测定6 次，结果表示为平均值±标准差。

取2.5 cm高的肉样，汽烹3 min，冷却后在CLM-3B嫩度仪上进行肌肉剪切力测定[12]，当切头到达最低端的时候，记下仪器上显示的数据。每个样品5 个平行，结果表示为平均值±标准差。

1.3.5 肌原纤维小片化指数及肌原纤维蛋白表面疏水性测定

测定方法根据文献[13]改进。取适量样品绞碎，每组准确称取2.0 g鱼泥，放于50 mL离心管中，加入20 mL蛋白提取A液（含0.02 mol/L Tris-HCl和0.1 mol/L氯化钾），在高速匀浆机上匀浆0.5 min，4 ℃离心20 min，弃上清液，重复3 次。得到的沉淀，加入20 mL蛋白提取B液（含0.02 mol/L Tris-HCl和0.6 mol/L氯化钾），高速匀浆，4 ℃离心20 min，弃去沉淀。得到的上清液即为鱼肉纤维蛋白提取液。纤维蛋白浓度用双缩脲反应来测定。将肌原纤维悬浮液稀释，然后搅拌均匀，放入比色皿，采用紫外分光光度计于540 nm波长处测定吸光度。每0.5 mg/mL的肌原纤维蛋白的吸光度乘以200，得到的数值即为肌原纤维小片化指数（myofibrillar fragmentation index，MFI）。每个样品3 个平行，结果表示为平均值±标准差。

吸取提取的蛋白溶液5 mL于500 mL的容量瓶中，分别配制成不同质量浓度的蛋白溶液（质量浓度约在0.005～0.100 g/L），取不同质量浓度的蛋白溶液各5 mL，加入8 mmol/L的8-苯氨基-1-萘磺酸溶液，然后振荡均匀，放暗处静置20 min。设置荧光光度计激发波长为390 nm，进行发射波长在0～470 nm范围内的荧光强度扫描。记录荧光强度，表征所测蛋白提取液中蛋白质疏水性。每个样品3 个平行，结果表示为平均值±标准差。

1.3.6 肌原纤维蛋白变化观察

采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）研究不同嫩化时间下鱼肉肌原纤维蛋白的变化[14]。采用垂直板式电泳槽，12%分离胶与4%浓缩胶，标准蛋白质加样量为10 μL，待测样质量浓度为2 mg/mL，加样量为20 μL。先在60 mV的电压下电泳，待样品进入分离胶后，将电压调整至100 mV左右，当溴酚兰指示带接近胶底l cm时，停止电泳。小心将凝胶取下，用5%戊二醛固定1 h，置于染色容器中用考马斯亮蓝R-250染色液（质量浓度为2.5 mg/mL）染色5～6 h，脱色液脱色1 h，胶片观察灯上拍照记录。

1.3.7 鱼肉表面微结构观察（扫描电镜）

鱼肉样品在2.5%戊二醛溶液中固定2 h，用0.1 mol/L

的磷酸盐缓冲液（pH值6.8）冲洗3 次，每次10 min。然后分别用体积分数50%、70%、95%和100%的乙醇脱水，每次10～15 min。用乙醇-叔丁醇（1∶1，V/V）溶液浸泡15 min，再用叔丁醇浸泡15 min。固定好的鱼肉置-70 ℃冷冻，用切片机切成薄片，冷冻干燥24 h[2]。将样品送武汉大学测试中心用扫描电镜进行观察。样品用双面胶黏于样品台上，用离子溅射器镀铂膜，膜厚度约为100 ?。测试条件为加速电压10 kV，能量分辨率：Mn kα132 eV，放大倍数分别为80 倍，观察并拍照具有代表性的表面微观结构。

1.4 数据处理

pH值、色差值及质构特性结果采用IBM SPSS Statistics 18.0软件进行数据处理，最小显著差数法（least significant difference，LSD）进行差异显著性分析。剪切力、鱼肉肌原纤维蛋白表面疏水性和肌纤维小片化指数的数据结果，采用Microsoft Excel软件进行处理并作图，各数据以平均值±标准差表示，Students t检验进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 嫩化时间对鲈鱼鱼肉pH值及色差值的影响

由表1可知，随着嫩化时间的延长，样品pH值呈现先下降后上升再下降的趋势。嫩化剂作用0.5 h后鱼肉pH值降至最低，作用1.5 h后鱼肉pH值升至最高7.59±0.04，与对照组差异显著（P<0.05）。这是因为复合磷酸盐有助于鱼肉pH值的提高，使肌肉中肌球蛋白和肌动蛋白偏离等电点（5.4）而溶解，促使鱼肉嫩化。此外，肌肉pH值会影响钙蛋白酶活性，高pH值有利于提高钙蛋白酶活性，促进鱼肉嫩度提高[15]。

鱼肉色差值L*代表肉样的亮度值，该值越大肉光泽度越好，a*代表肉样红度值，b*代表肉样黄度值，b*值越小表明肉越新鲜[16]。由表1可知，鱼肉L*呈先下降后上升再下降的趋势，在1.5 h时达到最高约57.06，与对照组差异显著（P<0.05）。a*先下降后上升，嫩化1.5 h时a*值和对照组差异不显著。b*先上升后下降，并在嫩化1.5 h时降至约0.34，显著低于对照组（P<0.05）。以上结果表明，嫩化1.5 h时，鱼肉色泽最好。

2.2 嫩化时间对鲈鱼鱼肉质构特性的影响

由表2可知，鱼肉的硬度、黏性、咀嚼性和回复力均呈现先下降后上升的趋势，嫩化1.5 h时出现最小值，并与对照组差异显著（P<0.05），尤其硬度和黏性指标降低幅度分别达57.38%和79.41%。这可能因为嫩化时间越长，木瓜蛋白酶作用使鱼胶原降解、肌纤维断裂[6]，另一方面，Ca2+浓度越高，钙激酶活性增强，从而降解肌原纤维蛋白和连接蛋白[17]，因此鱼肉硬度、黏度和咀嚼性下降。

2.3 嫩化时间对鲈鱼鱼肉剪切力的影响

Fig. 1 Tenderness of largemouth bass meat as a function of tenderization time

由图1可知，鱼肉剪切力随嫩化时间的延长先下降后上升。嫩化1.5 h时，鱼肉剪切力最小为（21.89±0.27） N，与对照组相比降低33.83%，差异极显著（P<0.001）。这可能是综合作用的结果：一是肌浆中Ca2+浓度提高，增强钙激酶活性和缩短酶激活时间，进而降解肌原纤维蛋白和连接蛋白，使剪切力下降[18]；

二是复合磷酸盐能够通过提高离子强度，促使肌球蛋白从肌原纤维中溶解出来，从而提高肉的保水性而增加肉品嫩度[19]；三是蛋白酶作用使肌纤维断裂，肌肉纤维小片化程度加大[5]，鱼肉剪切力下降。但作用时间超过1.5 h，鱼肉剪切力上升，这是因为肌动球蛋白质的过度裂解和结缔组织的过分降解会造成肌肉超微结构的过度破坏，导致肌肉结构过于松散，保水性降低液体流失[20]，从而鱼肉剪切力上升。

2.4 嫩化时间对鲈鱼鱼肉肌原纤维蛋白表面疏水性和肌纤维小片化指数的影响

Fig. 2 Change in myofibrillar protein surface hydrophobicity and myofibrillar fragmentation index with tenderization time

由图2可知，实验组鱼肉肌纤维蛋白表面疏水性增加，但与对照组无显著差异（P>0.05）。肌纤维蛋白表面疏水性增加意味着蛋白构象发生变化，分子伸展开或断裂，使得非极性的氨基酸残基暴露在蛋白质分子表面[21]。另一方面，鱼肉嫩化1.0～2.0 h时肌原纤维小片化指数显著增加，最高可达108.6±8.8，与对照组相比提高47.96%。肌原纤维小片化指数是衡量肉类嫩度的重要指标[13]，代表肌原纤维蛋白质水解的程度，其值增加表明实验中鱼肉肌纤维蛋白水解程度上升。

2.5 鲈鱼鱼肉肌原纤维蛋白的变化

Fig. 3 Myofibrillar protein bands of largemouth bass meat by SDS-PAGE

由图3可知，鲈鱼肉肌原纤维蛋白主要有8 个条带，从上至下分别为：肌球蛋白重链（L链）、α-辅肌动蛋白、肌钙蛋白、结蛋白、肌动蛋白、原肌球蛋白、原肌球蛋白亚基、及肌球蛋白碱性轻链，该结果与Teixeira等[14]的报道一致。嫩化导致鱼肉肌原纤维蛋白成分发生了变化，嫩化1.5 h后分子质量38 kD的蛋白和原肌球蛋白减少，在约37 kD处左右产生了新的蛋白条带（图3白框标注处）。大分子蛋白降解与钙激酶和木瓜蛋白酶的酶解作用有关，也与肌纤维小片化指数升高结果相符合。

2.6 鲈鱼鱼肉嫩化前后表面微观结构观察

Fig. 4 Surface microstructure of largemouth bass meat at different tenderization times by scanning electron microscope （× 80）

鲈鱼肌肉微观结构包括肌纤维的直径、密度、肌纤维间组织等[22]。由图4A可知，不加嫩化剂的鱼肉纤维较细、肌纤维密度大、排列紧密。由图4B可知，嫩化0.5 h，鱼肉肌纤维结构完整但肌纤维变粗、纤维密度变小，纤维间连接组织少，这跟肉眼观察到的嫩化后鱼肉块变大结果相印证。此阶段可能主要为复合磷酸盐作用，加快了鱼肉肌原纤维中的肌球蛋白和肌动蛋白溶解[23]，

鱼肉持水性增加。由图4C、D可知，嫩化1.0～1.5 h，鱼肉肌纤维有断裂现象，纤维表面肌束膜不明显，该实验结果与蛋白酶水解牛肉结果相符[5]。此阶段主要是酶的作用，鱼肉内源酶——钙激酶活性增加，导致鱼肉肌原纤维崩裂，从而使肌节部位断裂[24-25]，此外外源酶——木瓜蛋白酶的作用也显现，并通过先水解胶原再水解肌原纤维蛋白的方式来提高肉品嫩度[13]。由图4E可知，嫩化2.0 h，鱼肉有糜化现象，这是由于长时间酶解导致肌纤维和结缔组织被过度降解[26]。

3 结 论

用复合嫩化剂（氯化钙1.2‰、复合磷酸盐1.2‰、木瓜蛋白酶1.8‰）嫩化鲈鱼半成品1.0～1.5 h，可显著降低鱼肉剪切力和硬度，提高鱼肉pH值和亮度，并增加鱼肉肌原纤维蛋白表面疏水性和肌原纤维小片化指数。

SDS-PAGE结果表明，嫩化后鱼肉肌原纤维中分子质量38 kD的蛋白和原肌球蛋白发生降解；扫描电镜结果表明，嫩化1.0～1.5 h后鱼肉组织变得蓬松、肌纤维间连接物消失、肌肉纤维发生断裂。该嫩化剂效果良好，嫩化1.0～1.5 h可显著提升鱼肉半成品嫩度与口感，适合工业生产中使用。

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