HPLC-UV切换波长法同时测定复方甘草合剂中甘草苷、异甘草苷、甘草素和甘草酸

任明，许真真 (郑州大学第二附属医院中药学部，郑州 450001)



HPLC-UV切换波长法同时测定复方甘草合剂中甘草苷、异甘草苷、甘草素和甘草酸

任明，许真真 (郑州大学第二附属医院中药学部，郑州 450001)

摘要：目的建立同时测定复方甘草合剂中甘草苷、异甘草苷、甘草素和甘草酸的含量的评价方法。方法3批复方甘草合剂(批号：130112、130113、130201)。制备甘草苷、异甘草苷、甘草素和甘草酸混合对照品溶液、供试品溶液、阴性供试品溶液(复方甘草合剂缺甘草的阴性样品)。采用Venusil XBP-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，0.4%冰醋酸-甲醇梯度洗脱，体积流量为1.0 mL/min，运用HPLC-UV切换波长法检测3种溶液。结果甘草苷、异甘草苷、甘草素和甘草酸分别在44.20～1 326、8.92～267.6、13.68～410.4和148.40～4 452 ng范围内线性关系良好(r分别为0.999 2、0.999 1、0.999 2、0.999 6)，加样回收率分别为98.63%(RSD=1.12%)、99.13%(RSD=1.04%)、98.65%(RSD=1.06%)和99.10%(RSD=0.90%)。批号为130112的复方甘草合剂中甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草酸含量分别为67.22、17.00、24.82、2 881.93 μg/mL，RSD分别为1.32%、0.87%、2.34%、2.17%；批号为130113的复方甘草合剂中甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草酸含量分别为68.59、16.99、23.74、2 798.72 μg/mL，RSD分别为1.99%、1.33%、1.69%、1.86%；批号为130201的复方甘草合剂中甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草酸含量分别为67.91、15.98、24.16、2 824.55 μg/mL，RSD分别为2.17%、2.21%、1.77%、0.97%。结论HPLC-UV切换波长法可用于同时测定复方甘草合剂中甘草苷、异甘草苷、甘草素和甘草酸的含量。

关键词：复方甘草合剂；HPLC-UV切换波长法；甘草苷；异甘草苷；甘草素；甘草酸

复方甘草合剂是由甘草流浸膏、复方樟脑酊、愈创木酚甘油醚及甘油等药物组成的中药制剂，可祛痰镇咳，主要用于治疗咳嗽和上呼吸道感染。甘草苷、异甘草苷、甘草素和甘草酸是合剂中主药甘草的重要活性成分[1,2]。近年诸多相关研究多对甘草中甘草酸进行了含量测定，而其他成分少见报道。为更好地确定本品质量稳定性，本实验依据相关资料[3,4]，采用高效液相色谱仪器联用紫外检测器通过变波长法(HPLC-UV切换波长法)对复方甘草合剂中甘草苷、异甘草苷、甘草素和甘草酸的含量进行测定，并进行相应的方法学考察，以期为该合剂的质量控制提供简易可靠的定量评价方法。

1材料

Waters高效液相色谱仪系统(Waters2695 Separations Module，Waters 2996 Photodiode Array Detector Madein Singapore，美国Waters);XS105型电子分析天平;Kp200DB型超声波清洗器;SHE-D(III)循环水式真空泵。甘草苷对照品(批号：111610-201106)购自中国药品生物制品检定所，甘草酸对照品(批号：1405-86-3)，异甘草苷对照品(批号：120526)和甘草素对照品(批号：100927)均购自四川成都曼思特生物科技公司；复方甘草合剂购自广西广明药业(批号：130112、130113、130201)；甲醇(Fisher Scientific)，屈臣氏纯净水。

2方法与结果

2.1色谱条件色谱柱：Venusil XBP-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm，博纳艾杰尔)，流动相为0.4%冰醋酸(A)-甲醇(B)，梯度洗脱A为50%→25%→25%→50%→50%，相应时间周期为0→15→30→35→40 min，体积流量为1.0 mL/min，紫外检测波长为276 nm(0～12 min)、370 nm(12～23 min)、276 nm(23～40 min)，柱温30 ℃，进样体积10 μL。

2.2样品溶液的制备

2.2.1混合对照品溶液的制备精密称取甘草苷、异甘草苷、甘草素和甘草酸对照品适量置于10 mL容量瓶中，70%乙醇稀释并定容，制成各对照品储备液。甘草苷、异甘草苷、甘草素和甘草酸质量浓度分别为221.00、223.00、171.00、742.00 μg/mL。精密量取对照品储备液于量瓶中，70%乙醇稀释并定容，制成混合对照品溶液，甘草苷、异甘草苷、甘草素和甘草酸质量浓度分别为44.20、8.92、13.68、148.40 μg/mL。

2.2.2供试品溶液的制备精密量取复方甘草合剂1 mL，水浴蒸干，残渣经甲醇超声处理，功率300 W，频率40 kHz，30 min使其溶解，放冷，收集溶解液及洗液于2 mL容量瓶，加甲醇至刻度，摇匀并滤过，取续滤液，即得。

2.2.3阴性供试品溶液的制备制备复方甘草合剂缺甘草的阴性样品，按“2.2.2”项供试品溶液的制备方法处理得缺甘草的阴性样品溶液。

2.3专属性将混合对照品、阴性供试品溶液及供试品溶液分别注入高效液相色谱仪，按照上述色谱条件进行检测。结果显示各待测成分对应保留时间处无其他吸收峰，表明阴性无干扰。

2.4甘草苷、异甘草苷、甘草素和甘草酸的线性关系精密吸取混合对照品溶液1、5、10、20、30 μL注入液相色谱仪，按照上述色谱条件进行测定，以进样量为横坐标，色谱峰峰面积为纵坐标，计算回归方程与相关系数并绘制标准曲线，结果表明甘草苷、异甘草苷、甘草素和甘草酸在检测范围内线性关系良好(r分别为0.999 2、0.999 1、0.999 2、0.999 6)，线性范围分别为44.20～1 326、8.92～267.6、13.68～410.4、148.40～4 452 ng。

2.5复方甘草合剂稳定性试验精密吸取新制备的同一供试品溶液(批号：130112)，于0、2、4、6、8、10、12 h进样10 μL进行含量测定，结果显示，甘草苷、异甘草苷、甘草素和甘草酸含量分别为68.44、17.83、24.06和2 917.86 μg/mL，RSD分别为1.68%、0.87%、2.89%和2.98%。

2.6复方甘草合剂中间精密度试验取复方甘草合剂(批号：130112)6份，分别由两人在不同的时间按照“2.2.2”项下供试品溶液方法进行制备，注入高效液相色谱仪进行测定，结果显示甘草苷、异甘草苷、甘草素和甘草酸平均含量分别为68.14、16.28、24.18和2 902.40 μg/mL，RSD值分别为2.50%、0.72%、2.81%和2.65%。结果表明精密度良好，符合定量分析要求。

2.7复方甘草合剂重复性试验取复方甘草合剂(批号：130112)5份，分别由两人在不同的时间按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液并进行测定，结果显示甘草苷、异甘草苷、甘草素和甘草酸平均含量分别为67.32、17.46、23.76和2 946.24 μg/mL，RSD值分别为1.84%、2.21%、2.82%、2.85%和2.53%。结果表明精密度良好，符合定量分析要求。

2.8复方甘草合剂耐用性考察对液相测定中一些变动因素进行考察。

2.8.1不同体积流量精密吸取供试品和混合对照品溶液入液相色谱仪进行含量测定，体积流量分别设定为0.8、1.0、1.2 mL/min，测得甘草苷、异甘草苷、甘草素和甘草酸平均含量分别为70.42、16.66、23.92和300.24 μg/mL，RSD值分别为1.58%、1.12%、2.16%和1.97%。

2.8.2不同色谱柱精密吸取供试品和混合对照品溶液，分别使用3种不同型号的色谱柱(Agela，V9520525ck0063；Sepax,02040917032；Waters,WAT045905)进行检测，其他按上述条件进行测定，甘草苷、异甘草苷、甘草素和甘草酸RSD值分别为1.37%、2.91%、1.36%、2.11%。

2.9复方甘草合剂加样回收率检测取已测得含量的复方甘草合剂样品(批号：130112)0.5 mL共3份，按照0.5 mL样品成分含量的80%、100%、120%分别精密加入各对照品储备液，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液并进行含量测定，计算回收率。甘草苷、异甘草苷、甘草素和甘草酸的平均回收率分别为98.63%、99.13%、98.65%、99.10%，RSD值分别为1.12%、1.04%、1.06%、0.90%。

2.10复方甘草合剂中甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草酸含量测定取3批复方甘草合剂(批号：130112、130113、130201)，每批各3份，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，注入高效液相色谱仪进行含量测定。结果见表1。

表1　不同批号复方甘草合剂中甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草酸含量及RSD

3讨论

复方甘草合剂由甘草流浸膏、复方樟脑酊、愈创木酚甘油醚及甘油等药物组成。樟脑酊则是中枢性镇咳药，辅料甘油有助于将药物附于咽喉部并起到滋润作用，尤其适用于痰多的咳嗽患者[5～9]。临床研究[10,11]表明，服用复方甘草合剂可使患者咯痰咳嗽等症状和胸部体征得到明显改善，理化检查趋于正常。复方甘草合剂推广多年，是经诸多临床验证的镇咳药。主药甘草性甘、平，归心、肺、脾、胃经，可调和诸药，益气补脾，祛痰止咳，清热解毒。甘草根表皮以内部位含有的大量甘草苷、异甘草苷、甘草素和甘草酸等黄酮类物质是其重要的活性物质，具有显著的末梢镇咳作用，对其进行质量控制对保持复方甘草合剂临床疗效的稳定性有非常重要的作用[12～14]。

在原标准中药品中没有甘草流浸膏的质量控制标准，关于本品的相关研究中多对单一一种物质进行质量控制，没有同时对这四种成分进行含量测定。本实验参考相关资料，采用高效液相色谱仪器联用紫外检测器通过变波长法对这4种成分进行含量测定，并进行相应的方法学考察，以期为该合剂的质量控制提供简易可靠的定量评价方法。甘草流浸膏中4种成分性质相似，但含量却有较大差异。经检测发现，甘草素、甘草酸与甘草苷在270 nm范围处有最大吸收，而异甘草苷在360 nm处有较大吸收，吸收波长有较大差异，因此采用变波长紫外检测器进行检测，依据药物保留时间变化检测波长，能更准确地对4种物质的含量进行检测。中药成分多且复杂，等梯度洗脱未能获得较好的分离效果，待测物质吸收峰易受干扰，因此选用了梯度洗脱。本研究在流动相选择的过程中对甲醇-冰醋酸缓冲液、甲醇-水、乙腈-磷酸盐缓冲液等流动相的洗脱进行比较，结果显示流动相选用甲醇-0.4%冰醋酸时峰形良好且分离效果最佳。在进行系统流速考察时发现，当流速为0.8 mL/min时色谱峰偶见拖尾且洗脱时间延长，当流速为1.2 mL/min时系统压力稍升高且待测物质色谱峰与杂质峰分离度较低，流速为1.0 mL/min时峰形良好且洗脱时间适当，因此在含量测定中选用流速为1.0 mL/min。另外，复方甘草合剂属于中药制剂，不同制备工艺、不同批号、不同储存环境等因素均会对其有效成分产生一定的影响，导致含量测定结果不一样。

本实验采用HPLC-UV切换波长法同时测定了复方甘草合剂中甘草苷、异甘草苷、甘草素和甘草酸的含量，实验结果表明此方法灵敏简便、重现性好，且有较高的准确性，可为甘草合剂质量控制标准提供参考依据。

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(收稿日期：2015-08-28)

中图分类号：R917

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)11-0035-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.11.013

基金项目：河南省科技攻关计划项目(132102310156)。