七氟醚预处理对缺血再灌注损伤小鼠脑组织的保护作用及其机制探讨

王民，杨永安，耿垚，刘芳，李伟，王小磊 (河北大学附属医院，河北保定 071000)



七氟醚预处理对缺血再灌注损伤小鼠脑组织的保护作用及其机制探讨

王民，杨永安，耿垚，刘芳，李伟，王小磊 (河北大学附属医院，河北保定 071000)

摘要：目的观察七氟醚预处理对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用，并探讨其可能机制。方法60只雄性健康昆明小鼠随机分为假手术组、模型组和预处理组，每组20只。假手术组和模型组输纯氧气60 min，预处理组输入氧气及2.4%七氟醚60 min，用纯氧洗脱10 min。模型组和预处理组利用线栓法建立小鼠脑缺血再灌注损伤模型，于再灌注24 h时，计算小鼠神经功能缺损评分和脑梗死体积百分比，利用RT-PCR检测小鼠海马组织中的TREK-2、Caspase-3 mRNA。结果预处理组和模型组小鼠神经功能缺损评分和脑梗死体积百分比较假手术组高，且预处理组较模型组低(P均<0.05)。预处理组和模型组小鼠海马组织TREK-2 mRNA相对表达量较假手术组高，且预处理组较模型组高(P均<0.05)。预处理组和模型组小鼠海马组织Caspase-3 mRNA相对表达量较假手术组高，且预处理组较模型组低(P均<0.05)。结论七氟醚预处理对缺血再灌注损伤小鼠脑组织具有保护作用，可能与其增加海马组织TREK-2表达、减少Caspase-3表达有关。

关键词：七氟醚；脑缺血再灌注损伤；TREK-2基因

脑缺血再灌注损伤作为神经外科较为常见的围术期不良事件，严重影响手术治疗效果及患者预后[1]。七氟醚作为常用的吸入性全麻药，有研究[2]指出，颅脑手术行七氟醚预处理可有效保护脑组织，减轻缺血再灌注对脑组织的损伤作用。研究[3]表明，双孔钾通道含有4个跨膜片段与2个孔道结构，与中枢神经系统生理功能关系密切，在调节神经元膜电位及体温、脑缺血保护等功能中发挥重要作用。TREK-2作为双孔钾通道重要类型，在中枢神经系统中分布具有特异性，可通过减少细胞外Ca2+内流而保护神经元细胞[4]。本研究观察了七氟醚预处理对缺血再灌注损伤小鼠脑组织的保护作用，并探讨其可能机制。

1材料与方法

1.1实验动物及分组清洁级雄性健康昆明小鼠60只由河南省实验动物中心提供(合格证号：医动字第99013号)，8周龄，体质量22～28 g，饲养于通风、清洁环境中，温度20～24 ℃，相对湿度50%～70%，自由饮水。利用随机数字表法将其随机分为假手术组、模型组和预处理组，每组20只。

1.2主要试剂与设备七氟醚购自上海恒瑞医药有限公司(批准文号：国药准字p0070172)，TREK-2、Caspase-3及内参引物均由上海生工公司设计完成，TRIzol总RNA提取试剂盒购自美国Gibco公司，逆转录试剂盒和PCR试剂盒均购自美国Invitrogen公司，紫外分光光度计购自北京普析通用仪器有限责任公司，数码相机购自日本Sony公司，PCR仪购自瑞士Roch公司。

1.3小鼠脑缺血再灌注损伤模型制备及七氟醚用法所有小鼠禁食12 h后，置于半封闭有机玻璃箱中，钠石灰铺于箱底，使箱内PCO2低于375 mmHg，并采取灯泡加热，维持箱内温度在35～38 ℃。箱侧面留2个通气孔，假手术组和模型组一孔用于输入纯氧气60 min；预处理组一孔连接麻醉气体挥发罐输入氧气及2.4%七氟醚60 min，用纯氧洗脱10 min，另一孔连接麻醉气体分析仪，对氧气、七氟醚及二氧化碳进行监测。于60 min后，行10%水合氯醛腹腔注射麻醉，根据文献[5]中的方法利用线栓法构建小鼠缺血再灌注损伤模型。取颈部正中切口，对右侧颈总动脉、颈外动脉进行分离，将颈外动脉分支进行结扎，将颈总动脉于近心端结扎，假手术组小鼠完成操作；模型组和预处理组小鼠继续将颈总动脉远端用血管夹进行夹闭，于颈总动脉分叉处剪一小口，并将50 mm长的尼龙鱼线置入颈内动脉，直到出现轻微阻力时停止放入，深度为1.8～2.0 cm；缺血持续120 min后，将线栓取出使血液恢复灌注。手术操作过程中小鼠均自主呼吸，直肠温度维持在37～38 ℃。麻醉清醒后，小鼠均放回笼子饲养，自由饮食、饮水。

1.4小鼠神经功能缺损评分和脑梗死体积百分比计算方法于再灌注24 h时，对所有小鼠神经功能缺损情况进行评估[6]：运动功能评分实验(小鼠放地上可正常行走0分，能直线行走1分，往瘫痪侧转圈2分，倒向瘫痪侧3分；将小鼠尾巴提起，后肢屈曲或前肢屈曲或头部在30 s内偏离身体纵轴>10°记1分)、平衡功能评分实验(完成并保持平衡记0分，将平衡木一端完全抓住记1分，将平衡木抱住时一个肢体出现滑落记2分，将平衡木抱住时两个肢体滑落或旋转超过60 s记3分，旋转在41～60 s滑落记4分，旋转在20～40 s滑落记5分，旋转在20 s内滑落记6分)、反射或运动异常评分(角膜反射或羽翼反射或惊恐反应消失或出现肌张力障碍、抽搐、肌阵挛均记1分)。于神经功能缺损评估后，每组各取小鼠10只，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后处死并取脑组织，置于冰盐水15 min，于冠状面对脑组织进行切片，厚度2 mm，置于37 ℃ TTC溶液中，行染色40 min，用甲醛固定24 h，利用数码相机拍照后转入电脑，用专业图像分析软件进行分析，为避免同侧脑水肿对脑体积产生的影响，用对侧正常脑组织体积进行计算。脑梗死体积百分比=(对侧正常脑体积-同侧正常脑体积)/对侧正常脑体积×100%[7]。

1.5小鼠海马组织TREK-2、Caspase-3 mRNA检测采用荧光定量PCR。将每组余下的10只小鼠处死后，取海马组织进行研磨，利用细胞裂解液进行裂解，用TRIzol总RNA提取试剂盒获得总RNA，利用紫外分光光度计进行检测，取A260/A280>1.80样品完成后续实验。利用逆转录试剂盒逆转录为cDNA，以cDNA为模板用PCR试剂盒完成PCR，TREK-2引物序列上游：5′-CGTCCATCGTCCCAAATT-3′，下游：5′-TTGGAGGAGTTTCCTACCG-3′；Caspase-3引物序列上游：5′-TCGAGGTCGACGGATTCGATG-3′，下游：5′-CCGCTCTAGAACTAGTGGATC-3′。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性60 s，56 ℃ 30 s，74 ℃ 30 s，连续进行38个循环。每个样品均设置3个平行反应复孔。以β-actin为内参，扩增产物经凝胶电泳后拍照，利用图像分析软件对条带灰度值进行分析，获得TREK-2 mRNA和Caspase-3 mRNA相对表达量。

2结果

3组小鼠神经功能缺损评分和脑梗死体积百分比比较见表1。3组小鼠海马组织TREK-2、Caspase-3 mRNA表达比较见表2。

表1　　　　3组小鼠神经功能缺损评分和脑梗死体积

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

表2　　　　3组小鼠海马组织TREK-2、Caspase-3 mRNA

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

3讨论

脑缺血再灌注损伤作为神经外科围术期常见的不良反应，严重影响手术治疗效果及患者预后，增加了患者手术风险[8]。因此，如何有效预防或减轻脑缺血再灌注损伤已成为临床研究重点。本研究参考文献[5]采用线栓法制备小鼠脑缺血再灌注损伤模型，结果显示预处理组和模型组小鼠神经功能缺损评分和脑梗死体积百分比均高于假手术组，说明小鼠脑缺血再灌注损伤模型建立成功。在确定七氟醚预处理吸入剂量时，主要参照有关文献[9]及预实验结果，本研究采取麻醉气体挥发罐输入氧气及2.4%七氟醚60 min进行处理。

TREK-2是重要的双孔钾通道亚型，可被细胞膨胀、张力、负压等机械张力和多不饱和脂肪酸激活，在病理状态下可能发挥保护作用[10]。本研究显示，当小鼠发生脑缺血再灌注损伤时海马组织中TREK-2 mRNA相对表达量显著增加，且七氟醚预处理会进一步增加TREK-2表达。TREK-2通道的开放增加可引发神经元超级化，抑制电压依赖性钙离子通道及NMDA受体相关钙通道，减少Ca2+内流，有效保护神经元。TREK-2表达升高可能是神经元损伤后的反馈性保护调节机制，而七氟醚预处理更有利于TREK-2的表达[11]。在发生缺血再灌注损伤时，七氟醚预处理可进一步促进TREK-2通道大量开放，钾电流增加可对静息膜电位进行调节而抑制其他离子通道的活性，从而有效保护脑细胞[12]，同时，TREK-2通道大量开放可使神经元超极化，通过抑制钙通道而减少Ca2+内流，减少细胞内Ca2+水平而减少细胞凋亡的发生。Caspase-3作为凋亡执行蛋白，其表达水平可反映细胞发生凋亡的程度[13]。本研究结果还显示，七氟醚预处理可抑制海马组织中Caspase-3表达，说明七氟醚预处理有助于保护脑组织，减少神经元凋亡的发生。

综上所述，七氟醚预处理对缺血再灌注损伤小鼠脑组织具有保护作用，可能与其增加海马组织TREK-2表达、减少Caspase-3表达有关。

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(收稿日期：2015-10-05)

中图分类号：R743.33

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)11-0025-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.11.009

通信作者：王小磊(E-mail： 2019945399@qq.com)