Akt抑制剂与利妥昔单抗联合应用对伯基特淋巴瘤细胞株Daudi增殖及凋亡的影响

杨玉婷，谭晓虹，岑洪 (广西医科大学附属肿瘤医院，南宁 530021)



Akt抑制剂与利妥昔单抗联合应用对伯基特淋巴瘤细胞株Daudi增殖及凋亡的影响

杨玉婷，谭晓虹，岑洪 (广西医科大学附属肿瘤医院，南宁 530021)

摘要：目的探讨Akt抑制剂(AZD5363)与利妥昔单抗联合应用对伯基特淋巴瘤(BL)细胞株Daudi增殖和凋亡的影响，并探讨其相关机制。方法培养人BL细胞株Daudi，将其分为对照组(只含等量溶媒)、AZD5363组(加入40 μmol/L AZD5363)、利妥昔单抗组(加入50 μg/mL利妥昔单抗)、联合用药组(加入40 μmol/L AZD5363+50 μg/mL利妥昔单抗)，置于培养箱中培养24～72 h。分别采用CCK8法、流式细胞术测算AZD5363、利妥昔单抗及两者联合对Daudi细胞的增殖抑制和凋亡率，采用Western blotting法检测细胞磷酸化Akt(p-Akt)和总Akt(T-Akt)蛋白。结果与AZD5363组、利妥昔单抗组相比，联合用药组在24、48、72 h时Daudi细胞增殖抑制率高(P均<0.05)。AZD5363组、利妥昔单抗组、联合用药组与对照组相比，联合用药组与AZD5363组、利妥昔单抗组相比，干预Daudi细胞48、72 h后细胞凋亡率高(P均<0.05)。对照组、AZD5363组、利妥昔单抗组、联合用药组细胞p-Akt相对表达量分别为0.59±0.06、0.33±0.03、0.45±0.04、0.18±0.04，AZD5363组、利妥昔单抗组、联合用药组与对照组相比，联合用药组与AZD5363组、利妥昔单抗组相比，P均<0.05。结论AZD5363与利妥昔单抗联合应用可增强对BL细胞株Daudi的增殖抑制作用，促使细胞凋亡，其作用机制可能是通过抑制Akt磷酸化，阻断PI3k/Akt信号转导通路，从而发挥抗肿瘤效应。

关键词：伯基特淋巴瘤；Daudi细胞；利妥昔单抗；磷酸化Akt

近年来，靶向治疗成为继手术、放疗、化疗后肿瘤治疗最有效的手段。分子靶向治疗药物血液学毒性低、患者耐受性好。已有证据表明，伯基特淋巴瘤(BL)的病理机制与PI3K/Akt信号通路异常密切相关，该通路持续活化及MYC基因过表达协同促进人BL的发生、发展。Akt是P13K/Akt信号转导通路的枢纽基因，通过Akt抑制剂AZD5363干扰该靶点，阻断PI3K/Akt通路，能否抑制Daudi细胞增殖、促进细胞凋亡目前研究较少。利妥昔单抗联合化疗的疗效优于单纯化疗，目前广泛应用于BL的治疗。本研究观察了Akt抑制剂AZD5363与利妥昔单抗联合应用对BL细胞株Daudi增殖和凋亡的影响，并探讨其机制。

1材料与方法

1.1主要试剂与仪器利妥昔单抗(10 mg/mL)为罗氏公司产品。AZD5363购自Selleck中国分公司。细胞增殖与毒性检测试剂盒(CCK8)购自上海七海复泰公司。RPMI1640细胞培养液及胎牛血清购自美国Gibco公司。Annexin V-PE凋亡试剂盒购自BD Biosciences公司。抗磷酸化抗体[磷酸化Akt(p-Akt)]、总Akt(T-Akt,均为抗兔多克隆抗体)、内参照GAPDH及其相对应的二抗均购自Abcam公司。流式细胞仪购自美国BIO RAD公司。

1.2细胞来源及培养BL细胞株Daudi购自中国科学院上海细胞库。细胞在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 μg/mL链霉素的RMPI1640培养液中悬浮生长,置于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养。收集对数生长期的细胞用于实验。

1.3AZD5363联合利妥昔单抗对Daudi细胞增殖影响的观察采用CCK8法。取对数生长期的Daudi细胞悬液，调整细胞密度为5×104/mL,以每孔100 μL接种于96孔板，细胞分为空白调零组(不接种细胞)、对照组(只含等量溶媒)、AZD5363组(分别加入5、10、20、40、80 μmol/L AZD5363)、利妥昔单抗组(分别加入25、50、75、100 μg/mL利妥昔单抗)，置于含有5% CO2的37 ℃孵箱内进行孵育24 h。25、50、75、100 μg/mL的利妥昔单抗作用24 h对Daudi细胞的抑制率分别为16.35%、18.15%、21.89%、24.36%，可见利妥昔单抗在体外对Daudi细胞表现出较弱的增殖抑制作用，50 μg/mL的利妥昔单抗对Daudi细胞的抑制率已基本达效应平台，因此本研究选用50 μg/mL作为联合用药的利妥昔单抗最终药物浓度。浓度为5、10、20、40、80 μmol/L的AZD5363作用24 h对Daudi细胞对应的抑制率分别为5.61%、13.42%、18.02%、21.32%、45.23%，随着AZD5363浓度的增加，其抑制率增加，选用中间抑制浓度40 μmol/L作为与利妥昔单抗(50 μg/mL)联合的干预浓度。取对数生长期的Daudi细胞悬液，调整细胞密度为5×104/mL,以每孔100 μL接种于96孔板，设置对照组(只含等量溶媒)、AZD5363组(加入40 μmol/L AZD5363)、利妥昔单抗组(加入50 μg/mL利妥昔单抗)、联合用药组(加入40 μmol/L AZD5363+50 μg/mL利妥昔单抗)，每组设6个复孔，孵育24～72 h。孵育结束加入10 μL CCK8试剂,孵育2 h，测定样品在450 nm的吸光度值。每个实验完成3次，计算细胞的增殖抑制率。

1.4 AZD5363联合利妥昔单抗对Daudi细胞凋亡影响的观察 取对数生长期的Daudi细胞悬液接种于25 mL培养瓶，按1.3设置对照组、AZD5363组、利妥昔单抗组、联合用药组，培养48～72 h后收集细胞，按照Becton Dieainson公司AnnexinV-PE双染试剂盒说明书处理后，采用流式细胞术检测各组Daudi细胞的凋亡情况。

1.5细胞p-Akt、Akt蛋白检测采用Western blotting法。取Daudi细胞悬液，按1.3设置对照组、AZD5363组、利妥昔单抗组、联合用药组，培养24 h后收集细胞，提取各组细胞的总蛋白，取40～60 μg蛋白上样，SDS-PAGE电泳50 min,4 ℃ 150 V转膜约1.5 h，封闭，洗膜，分别加入p-Akt、T-Akt、GAPDH的一抗,4 ℃孵育过夜，洗膜，加入二抗室温孵育,用显色剂显色成像，分析各条带灰度值，以GAPDH为内参校正相对蛋白表达量。

2结果

AZD5363组、利妥昔单抗组、联合用药组在24 h时Daudi细胞增殖抑制率分别为21.32%、18.15%、35.13%，48 h时分别为35.64%、20.44%、44.73%，72 h时分别为47.31%、22.19%、71.33%，联合用药组与AZD5363组、利妥昔单抗组相比，P均<0.05。对照组、AZD5363组、利妥昔单抗组、联合用药组干预Daudi细胞48 h后细胞凋亡率分别为12.53%、29.17%、19.96%、47.21%，72 h时分别为14.01%、40.70%、22.61%、65.23%，AZD5363组、利妥昔单抗组、联合用药组与对照组相比，联合用药组与AZD5363组、利妥昔单抗组相比，P均<0.05。各组p-Akt、T-Akt蛋白表达情况见表1。

表1　各组p-Akt、T-Akt蛋白表达比较

注：与对照组相比，*P<0.05；与AZD5363组、利妥昔单抗组相比，△P<0.05。

3讨论

BL是一种高侵袭性的非霍奇金淋巴瘤(NHL)，占全部NHL的3%～5%，占儿童全部淋巴瘤的30%～50%。通过高剂量强度的多药化疗、中枢神经系统侵犯的预防治疗、不断改善的支持治疗，BL患者的预后显著改善[1]。老年患者常常难以完成大剂量的多药化疗，这有可能是导致疗效不佳的重要原因。利妥昔单抗是针对CD20的单克隆抗体，在一些惰性淋巴瘤和侵袭性淋巴瘤的治疗中取得了非常好的效果，利妥昔单抗联合化疗已成为这些淋巴瘤的标准治疗方案[2,3]。

对于难以完成大剂量多药化疗的BL患者，能否通过分子靶向治疗来改善预后目前研究较少。小分子靶向治疗在一些血液系统恶性肿瘤和实体瘤中取得了非常好的疗效，而MYC基因异常是导致BL发生的病理生理学基础[4]，PI3K信号能够阻止MYC降解，维持其活性[5]。最近在BL中发现一些突变能够激活PI3K信号通路[6]，PI3K激活能在质膜上产生第二信使PIP3,导致Akt活化。活化的Akt通过磷酸化多种酶、激酶和转录因子等下游因子，进而调节细胞的功能(包括凋亡、DNA修复、细胞周期的停滞及葡萄糖代谢等)。研究证实PI3K/Akt通路在多种实体瘤、血液恶性肿瘤细胞系及体内的肿瘤持续活化[7,8]。应用PI3K/Akt通路抑制剂可以下调Akt的磷酸化，因而PI3K/Akt通路可作为治疗BL的靶点。PI3K抑制剂或Akt抑制剂对BL都具有抗肿瘤疗效，PI3K抑制剂如idelalisib、duvelisib等治疗BL的研究已较多，而Akt抑制剂治疗BL的研究则较少[9]。此外，亦有研究证实，Akt抑制剂AZD5363可以抑制41～182种实体及血液肿瘤细胞，单药或联合用药治疗多种恶性肿瘤具有潜在疗效[10]。因而，本实验对Akt抑制剂AZD5363、利妥昔单抗及两者联合作用于BL细胞株Daudi的化疗效果进行探讨。研究结果显示，AZD5363能够抑制Daudi细胞的增殖及促进细胞凋亡，而联合利妥昔单抗对Daudi细胞的生长抑制及促凋亡作用明显增强，单药利妥昔单抗对Daudi细胞作用不明显，仅有轻微的生长抑制及促凋亡作用。本研究结果显示，AZD5363组、利妥昔单抗组、联合用药组较对照组细胞p-Akt表达量低，联合用药组较AZD5363组、利妥昔单抗组细胞p-Akt表达量低，提示AZD5363、利妥昔单抗可能是通过抑制Akt蛋白磷酸化来抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。

可见，AZD5363与利妥昔单抗联合应用可增强对BL细胞株Daudi的增殖抑制作用并促使细胞凋亡，其作用机制可能是通过抑制Akt磷酸化，阻断PI3k/Akt信号转导通路，从而发挥抗肿瘤效应。

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Effects of Akt inhibitor combined with rituximab on proliferation and apoptosis of Burkitt′s lymphoma cell line Daudi

YANGYuting,TANXiaohong,CENHong

(TumorHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of Akt inhibitor (AZD5363) combined with rituximab on cell proliferation and apoptosis of Burkitt′s lymphoma (BL) Daudi cells in vitro, and to explore its mechanism. MethodsHuman BL Daudi cells were cultured and then were divided into four groups: the control group (treated by 1640 culture medium with fetal bovine serum), AZD5363 group (treated by 40 μmol/L AZD5363), rituximab group (treated by 50 μg/mL rituximab) and the combination group (treated by 40 μmol/L AZD5363 + 50 μg/mL rituximab). They were all put into the incubator for 24-72 h. The growth inhibition and apoptosis rate of Daudi cells were detected by CCK-8 colorimetry and flow cytometer respectively. In addition, the expression of phosphorylated Akt (p-Akt) and total Akt (T-Akt) was detected by Western blotting.ResultsThe growth inhibition rate of the combination group after 24, 48 and 72 h was significantly increased as compared with that of the AZD5363 and rituximab groups (all P<0.05). The difference of apoptosis rate among the control group and AZD5363 group, rituximab group and the combination group was statistically significant after 48 and 72 h, and the apoptosis rate in the combination group was higher than those of the AZD5363 and rituximab group after 48 and 72 h (all P<0.05). The expression of p-Akt in the control group, AZD5363 group, rituximab group and the combination group were respectively 0.59±0.06, 0.33±0.03, 0.45±0.04 and 0.18±0.04 after 24 h, and the difference of expression of p-Akt was statistically significant among the control group and experimental groups, between AZD5363 group and the combination group, between the combination group and AZD5363 group, rituximab group (all P<0.05). ConclusionsAZD5363 in combination with rituximab can significantly inhibit cell proliferation and promote the apoptosis of BL Daudi cells. Inhibition of Akt phosphorylation and blocking of PI3k/Akt signal transduction pathway may be the mechanism of its antitumor effect.

Key words:Burkitt′s lymphoma; Daudi cells; rituximab; phosphorylated Akt

(收稿日期：2015-12-07)

中图分类号：R733

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)11-0008-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.11.003

通信作者简介：岑洪(1971-)，男，硕士研究生导师，主任医师，主要研究方向为血液肿瘤的基础与靶向治疗。E-mail： cenhong02@163.com

第一作者简介：杨玉婷(1990-)，女，硕士研究生，主要研究方向为血液肿瘤的基础与靶向治疗。E-mail： 2403124794@qq.com

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81160298)；广西医疗卫生适宜技术研究与开发课题(S201301-02) 。