茵栀黄注射液抗胆汁淤积药效成分的筛选及其作用机制研究お

谭桢 刘爱明 罗敏 郭宾

[摘要]筛选茵栀黄注射液中的主要药效成分，评价其调节胆汁酸代谢相关基因，发挥护肝作用的机制。选用雄性健康ICR小鼠30只，分为6组：正常对照组、模型对照组、绿原酸组、栀子苷组、黄芩苷组、滨蒿内酯组。检测肝功能、肝组织病理学变化以及胆汁酸代谢相关基因的表达。绿原酸组小鼠血清ALT，AST，ALP，TBA水平分别为（1589±253），（1832±256），（2638±987） U·L-1，（4063±767） μmol·L-1，栀子苷组小鼠分别为（2054±236），（2428±519），（3509±503）U·L-1，（4286±711） μmol·L-1，均低于模型对照组（5952±1094），（12837±1797），（16952±962） U·L-1，（13250±3300） μmol·L-1。肝组织病理学分析显示，绿原酸组、栀子苷组小鼠肝细胞的坏死、炎性细胞浸润程度与模型对照组比较均显著减轻。荧光定量QPCR检测显示，给予绿原酸、栀子苷治疗后，胆汁酸代谢相关基因mRNA的变化较模型对照组均发生了代偿性的逆转。茵栀黄注射液中的绿原酸和栀子苷能有效改善胆汁淤积、肝功能及肝脏病理性损伤，并逆转ANIT引起的胆汁酸代谢相关基因mRNA变化，从而起到肝保护作用。

[关键词]茵栀黄注射液；绿原酸；栀子苷；胆汁酸代谢；肝内胆汁淤积

茵栀黄注射液由茵陈、栀子、金银花、黄芩等4 味中药组成，具有清热、解毒、利湿、退黄疸和降低转氨酶的作用[14]，临床广泛用于治疗胆汁淤积。茵栀黄注射液作为复方制剂，由于其配伍成分组成复杂，其具体药效成分及药理学机制尚不清楚。前期，本课题组采用LCMSITTOF分析技术，归属推导了24种成分，初步鉴定了茵栀黄注射液中的化学成分黄芩苷、绿原酸、栀子苷、黄芩素、汉黄芩苷、栀子酸、新绿原酸、咖啡酸、滨蒿内酯等[56]。其中，黄芩苷、绿原酸、栀子苷是含量较多的组分， 本研究将对这几种主要成分的药效活性进行筛选。

近年来，随着分子生物学的发展，对胆汁淤积疾病的分子生物学相关机制的研究也进一步深入。现已研究证实，分布于肝细胞膜血管侧膜转运体 Na+牛磺胆酸共转运多肽（Ntcp）、有机阴离子转运多肽2（Oatp2）及胆管侧膜转运体多药耐药相关蛋白2（Mrp2）、胆盐输出泵（Bsep）对胆酸盐及胆红素的转运具有重要作用[79]。因此，对胆汁酸代谢相关酶及转运体的研究成为治疗胆汁淤积的新方向。

绿原酸是茵陈的主要成分，有促进胆汁分泌和清热解毒等功效。研究发现，绿原酸对CCl4引起的肝毒性有明显的保护作用[10]。栀子苷作为栀子的主要成分，对酒精引起的急性肝损伤有一定保护作用[11]。研究报道黄芩苷固体分散体对小鼠D氨基半乳糖急性肝损伤有一定保护作用[12]。滨蒿内酯作为茵栀黄中的成分之一，能够通过激动CAR受体提高胆红素清除率[13]。本实验通过ANIT诱导肝内胆汁淤积小鼠动物模型，研究茵栀黄中的主要成分绿原酸、栀子苷、黄芩苷、滨蒿内酯等对ANIT诱导胆汁淤积的治疗作用以及对胆汁酸代谢相关转运体表达的影响，以期从分子水平探讨茵栀黄中主要成分的作用机制及靶点，为基于传统中药天然活性成分的发展提供理论基础。

1材料

α异硫氰酸萘酯（ANIT，Sigma公司）；绿原酸、栀子苷、黄芩苷、滨蒿内酯（中国食品药品检定研究院）；定量PCR试剂（SYBR Green PCR Master Mix，Roche公司）；定量PCR仪（LightCycle 480，Roche公司）；肝功能有关试剂盒（长沙永和阳光科技有限公司）。

雄性健康小鼠30只，体重（20±5）g，宁波大学实验动物中心提供，许可证号SYXK20130191。所有动物饲养于宁波大学实验动物房，室温恒定，经过适应性喂养，饮食、饮水正常者，无不良反应，即纳入实验。

2方法

21动物实验

雄性小鼠30只，随机分为正常对照组、模型对照组、绿原酸组、栀子苷组、黄芩苷组、滨蒿内酯组，每组各5只。绿原酸组、栀子苷组、黄芩苷组、滨蒿内酯组分别灌胃绿原酸、栀子苷、黄芩苷、滨蒿内酯（50 mg·kg-1·d-1，其中，绿原酸、黄芩苷、滨蒿内酯溶解于玉米油中，栀子苷溶解于生理盐水中），共计5 d。第4天，模型对照组、绿原酸组、栀子苷组、黄芩苷组、滨蒿内酯组分别采用ANIT灌胃1次（75 mg·kg-1），诱发小鼠急性肝内胆汁淤积病变。同时各组继续分别灌胃绿原酸、栀子苷、黄芩苷、滨蒿内酯，共计5 d，ANIT灌胃48 h后所有小鼠处死。

22标本采集及保存

小鼠于眼眶采血后，15 mL离心管收集血液，并脱颈处死。将其固定在手术台上，剪去腹部鼠毛，将腹部皮肤及皮下组织一并剪开，充分暴露肝脏，取新鲜肝组织，其中肝左叶至于10%中性福尔马林缓冲溶液中固定，后期进行病理学检查，其余部分标记后迅速置于放入干冰中速冻保存，后转入-80 ℃冰箱长期保存。

23血清生化指标检测

小鼠血液于2 000 r·min-1 离心5 min后取血清，生化分析仪测定血清中 AST（谷草转氨酶）、ALT（谷丙转氨酶）、ALP（碱性磷酸酶）、TBA（总胆汁酸）。

24肝脏病理切片

小鼠肝脏10%中性福尔马林缓冲溶液固定24 h后，脱水，石蜡包埋。常规切片，HE染色，显微镜观察肝脏病理形态学变化。

25胆汁酸代谢相关基因mRNA表达水平测定

251RNA提取肝脏组织中加入Triol，匀浆，分层，浓缩，沉淀，洗涤，溶解，提取总RNA，Nano Drop 2000测定吸光度A值，做总RNA的纯度检测。

252逆转录反应取1 μg总RNA，加入MMLV逆转录试剂，普通PCR仪中反应合成模板DNA，于-20 ℃保存备用。

253荧光定量RTPCR测定模板cDNA 1 μL，Master Mix 5 μL，上游引物02 μL，下游引物02 μL，DEPC水36 μL，组成10 μL的体系，荧光定量PCR仪中变性、退火、延伸。反应结束后，荧光定量PCR仪自动分析并计算结果。其中， 实验中所设计的引物序列见表1， 所有的引物序列均来源于引物数据库（http：//mouseprimerdepotncinihgov/）。

26数据统计

采用SPSS 120软件、Microsoft Excel 2003和Sigma Plot 110对生化分析结果及QPCR测定胆汁酸代谢相关基因结果进行分析，P<005表明各组数据存在差异，结果具有统计学意义。

3结果

31小鼠血清肝功能检测

与正常对照组相比，阳性对照组ALT和AST明显升高（P<0001），显示其存在肝细胞损伤，同时，ALP和TBA也显著增加（P<0001）。而与阳性对照组比较，绿原酸组与栀子苷组ALT，AST，ALP和TBA降低，黄芩苷组和滨蒿内酯组的ALP，ALT，AST与阳性对照组之间无明显差异，提示绿原酸和栀子苷能在一定程度上抑制ANIT诱导的肝毒性，对肝内胆汁淤积有明显的肝保护作用，而黄芩苷和滨蒿内酯血生化分析结果显示没有明显的保护作用，见图1。

32肝脏组织病理学变化

正常组，肝脏外观轮廓、颜色正常；肝组织病理观察，肝小叶结构清晰、肝细胞核大而圆，核膜清晰，胞浆丰富、淡染，见图2A。ANIT组（模型组），肝脏外观明显肿胀，有大片状灰白色出现；肝组织病理观察，有大面积病灶可见，肝小叶轮廓不清，大量炎细胞浸润，坏死明显，见图2B。黄芩苷组和滨蒿内酯组，仍有大面积病灶可见，病变症状未得到减轻，无明显肝保护作用，见图2C，2D。绿原酸及栀子苷组，中央静脉及肝窦轻度充血，点、灶状坏死散在分布，少许炎细胞浸润，坏死病灶明显减少，见图2E，2F，2G，2H。

33胆汁酸合成相关基因表达的影响

本实验中以荧光定量QPCR检测正常对照组、模型对照组、绿原酸组和栀子苷组小鼠肝脏组织胆汁酸合成相关基因mRNA的表达差异。模型对照组小鼠肝脏胆汁酸合成相关酶Cyp7a1，Cyp8b1 mRNA表达与正常对照组相比均显著降低，绿原酸和栀子苷组中胆汁酸合成酶的mRNA较模型对照组表达被逆转至正常水平，见图3。提示绿原酸和栀子苷可能通过改善ANIT诱导的胆汁酸合成酶mRNA的变化从而发挥肝保护作用。

34胆汁酸转运相关基因表达的影响

肝胆细胞膜相关转运蛋白有机阴离子转运多肽（Oatp）和钠离子牛磺胆酸协同转运多肽（NTCP）的mRNA在模型对照组、绿原酸组和栀子苷组中相比于正常对照组均表达升高，模型对照组中，多药耐药

相关蛋白Mrp2，Mrp3，Mrp4和钠依赖性胆盐转运体Ostb的mRNA表达较正常对照组升高，给予绿原酸、栀子苷治疗后，均出现降低，见图4。说明绿原酸和栀子苷对Mrp2，Mrp3，Mrp4以及Ostb mRNA表达水平的逆转作用可能是继发于ANIT的毒性反应，从而发挥肝保护作用。综上可知，胆汁酸体内代谢是一个复杂的过程，包括胆汁酸的合成、重摄取及排泄过程，本实验中胆汁酸代谢过程中相关转运体的变化情况见图5，说明绿原酸与栀子苷在一定程度上抑制了ANIT对转运体的改变，从而抑制ANIT所诱导的肝毒性，起到肝脏保护作用。

4讨论

ANIT是一种化学物质，自1952年一位美国专家首次用它复制出肝内胆汁淤积模型以来，被广泛应用于肝内胆汁淤积模型的复制。ANIT作为一种间接肝毒剂，主要损害肝内胆管上皮细胞，引起肝

内胆管增生及小叶间胆管周围炎症，从而造成胆管阻塞，形成明显的胆汁淤积，并伴有以点状坏死为主的肝实质细胞损害，产生胆汁淤积性黄疸，出现高胆红素血症和胆汁分泌降低。同时还引起膜脂质过氧化反应，致使肝细胞变性坏死，胞内ALT大量溢入血流。该模型复制简单易行，重复性好，是筛选和研究保肝药物及利胆药的理想实验动物模型[14]。

胆汁酸的代谢包括胆汁酸合成、转运和排泄。胆汁酸的原料为胆固醇，经过一系列的酶促反应，形成胆汁酸。胆汁酸有2种合成途径[15]，经典途径

是胆汁酸合成的主要途径，经典途径由胆固醇7α羟化酶（cholesterol 7αhydroxylase，CYP7A1）启动，CYP7A1是此反应的限速酶。胆汁酸合成的另一个途径称为替代途径，由甾醇27α羟化酶（CYP27A1）和甾醇12α羟化酶（CYP7B1）启动，最终生成鹅脱氧胆酸。研究报道称ANIT干预后会诱导SHP mRNA表达的增加，SHP与LRH1形成的二聚体会抑制Cyp7α1，Cyp8b1的表达[1618]。本研究中，ANIT诱导肝内胆汁淤积后，胆汁酸合成酶相关基因表达均降低，给予绿原酸和栀子苷治疗后表达恢复到正常水平。同样，ANIT诱导后，胆汁酸重摄取转运体Oatps和Ntcp mRNA表达降低，绿原酸和栀子苷治疗后恢复正常。Chisholm的研究指出HNF1α在调节重摄取转运体中发挥了重要作用，ANIT降低HNF1α以及转运体Oatps和Ntcp的mRNA表达[19]。以上研究说明，绿原酸和栀子苷可以从一定程度上代偿性逆转ANIT所引起的胆汁酸合成酶的降低。

在ANIT所诱导的胆汁淤积模型中，有研究发现大黄素对ANIT所引起的胆汁淤积型肝炎有好的保护作用，其中，大黄素主要通过抑制促炎因子、氧化应激损伤等发挥作用[20]。中药制剂丹宁片也能通过改善氧化应激以及抑制中性粒细胞浸润等途径起到肝保护作用[21]。在脂多糖（LPS）诱导的C56/BL6小鼠急性肝损伤模型中，给药50 mg·kg-1绿原酸后，肝脏颜色由黄色恢复为正常的淡红色，ALT，AST水平显著降低，且通过预先给药绿原酸，TLR4，TNFα，NFκB等炎症基因mRNA表达水平有所降低，提示绿原酸可能通过抗炎机制对LPS诱导的肝毒性起到保护作用[22]。在栀子苷保护酒精性肝损伤的研究中，抗氧化酶GSH，GST，GPx，CuZnSOD和CAT的活性上调，氧化应激肝损伤明显改善[11]。本研究中，病理学分析显示模型对照组中小鼠肝脏有大面积病灶可见，肝小叶轮廓不清，大量炎细胞浸润，绿原酸和栀子苷组中炎性细胞浸润明显减少。因此，绿原酸和栀子苷是否通过抑制炎症通路从而实现对ANIT诱导的胆汁淤积和急性肝损伤起到肝脏保护作用，有必要对其机制进行更加深入的了解，为天然药物的临床应用提供科学合理的理论依据。

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[责任编辑曹阳阳]