2013年- 2015年景德镇市流感病原学监测分析

2016-05-11涂智杰胡芹余慧宏闵文光

实验与检验医学 2016年2期

关键词：分离鉴定流感病毒

涂智杰，胡芹，余慧宏，闵文光

(景德镇市疾病预防控制中心，江西景德镇333000)

2013年- 2015年景德镇市流感病原学监测分析

涂智杰1，胡芹，余慧宏，闵文光

(景德镇市疾病预防控制中心，江西景德镇333000)

摘要:目的分析景德镇市近3年流感病原学监测数据，为流感防控提供参考。方法采集哨点医院流感样病例和不明原因肺炎的咽拭子标本，通过Real-PCR方法对标本进行流感病毒核酸检测和分型，流感病毒核酸检测阳性标本接种到MDCK细胞进行病毒分离，以人红细胞凝集及凝集抑制试验对流感病毒进行鉴定分型。结果共采集标本2554份，核酸检测阳性标本265份，分离出流感病毒184株，新甲型H1N1、A（H3N2）亚型和B型毒株均有发现。2013.4-2014.3年以新甲型H1N1和A(H3N2)为流行优势株，B型毒株两个系都有出现，但新甲型H1N1从2014年3月之后就没有再次出现；2014.4-2015.9主要流行株则为A（H3N2及B（Yamagata）少量出现的特点。数核酸阳性A(H3N2)亚型流感的MDCK细胞阳性分离率从85.71%降至59.02%，病毒血凝抑制效价也从1280降低到最低的40；核酸阳性B型流感病毒的MDCK细胞阳性分离率从62.07%上升到90.91%，病毒血凝抑制效价一般都在1280及以上。结论景德镇地区2013年4月-2015年9月期间，流感流行表现为新甲型（H1N1）短暂流行后，夏季主要以A(H3N2)流感为主，冬春季以B（Yamagata）型流感高发；A(H3N2)亚型的分离率逐年降低，B型流感病毒分离率上升；A（H3N2）亚型的抗原性变异较大，而B型的抗原性较稳定。

关键词：流感病毒；分离鉴定；血凝抑制效价；流感分型

流感是由流感病毒及其变异株引起的急性呼吸道传染病，是人类面临的主要健康问题之一。由于流感病毒易发生抗原性变异，人群对变异株普遍易感，因此流行具有周期性，并容易迅速导致世界性的大流行，对人群健康、甚至对社会稳定和发展产生重大影响，危害极大。本市在2014年4月的监测样品中就检出过1例输入性H7N9病例，因此流感监测的意义尤为重要。现将我市2013年4 月-2015年9月流感病原学监测结果报告如下。

1　材料与方法

1.1标本采集以景德镇市第二人民医院为哨点医院，根据《全国流感监测方案（2010）》[1]要求，于2013年4月-2015年9月间采集哨点医院内科门诊、内科急诊、发热门诊、呼吸科住院部具有流感样症状（体温≥38℃，伴咳嗽或咽痛之一）或不明原因肺炎，发热3d内的流感样病例咽拭子标本，放入3ml采样液的采样管中，4℃保存，48h内运送至流感网络实验室进行检测。

1.2病毒核酸检测

1.2.1流感病毒核酸（RNA）提取标本经震荡后，采用Rneasy Mini Kit (QIAGEN) RNA提取试剂盒进行流感样标本的核酸提取。提取的RNA保存于-80℃低温冰箱。

1.2.2流感病毒核酸Real-time PCR检测使用江苏硕世生物科技有限公司荧光PCR检测试剂盒，对标本进行A、B型流感检测及季节性A（H1N1）、季节性A（H3N2）、新甲型H1N1、禽流感H7N9流感病毒分型鉴定。以7.5μl反应缓冲液、5μl混合酶（反转录酶和Taq酶）、上下游引物及探针4μl和3.5μl去离子水的比例配制PCR反应液并按每孔20μl分装，加5μl待检测RNA模板进行扩增。扩增循环条件为：50℃反转录反应30min；95℃预变性5min后，以95℃10s、55℃40s、扩增45个循环，并在55℃时采集荧光信号。选择Ct小于38的咽拭子样品用于病毒分离。

1.3流感病毒分离与鉴定核酸检测阳性的标本接种MDCK细胞进行病毒分离。病毒分离过程按照《全国流感监测方案（2010）》[1]中的程序进行，收获的标本使用人“O”型血红细胞进行凝集实验（HA）分离到的HA≥8的流感毒株再进行红细胞凝集抑制（HI）实验，鉴定所用标准血清由CNIC统一提供，符合条件的毒株送中国疾病预防控制中心国家流感中心和江西省CDC疾检所（国家流感参比实验室）进行复核，准确率100%。

2　结果

2.1流感病毒检出情况2013年4月-2015年9月流感哨点医院共采集流感样病例患者咽拭子标本2554份，核酸检测阳性标本数265份，核酸阳性率平均为10.37%；详见表1。

2.2各型、亚型流感病毒分离情况各监测年份，A、B型病毒均可分离，A型病毒核酸阳性标本211份，B型病毒核酸阳性标本53份，共接种264份阳性标本；不明原因肺炎检测H7N9核酸阳性标本由于生物安全规定，上送国家流感中心，未在本实验室进行病毒分离；分离毒株共184份。核酸阳性标本病毒平均分离率分别为A型69.19%、B型71.69%，其中分离到季节性A（H3N2）亚型流感病毒111株、新甲流H1N1流感病毒35株、B型流感38株（1株为Victoria系，37株为Yamagata系）。A型阳性标本中新甲流H1N1流感病毒的分离率最高87.50%，但2014年4月以后未再出现；而A (H3N2)亚型在MDCK细胞中的分离率从85.70%下降到59.02%，呈逐年下降的趋势。B型流感病毒的分离率呈现逐年升高的特点，2015年4月以来分离率高达90.91%，详见表2，图1）。

2.3流感病毒的季节分布流感病毒总体流行表现为A、B型流感交替出现的特点，全年流感高发期有两个时间段分别为冬春季节（12月-来年4月）和夏季（6-8月）。2013年4月-2014年3月短暂集中的出现新甲流H1N1之后，2014-2015年新甲流H1N1彻底消失。2014年4月-2015年9月A （H3N2）流感主要流行时间为夏季（6-8月）；B型流感为冬春季节高发并且主要以B（Yamagata）型为主。（图1，图2）

2.4各分离株与抗血清的抑制效价A(H3N2)病毒的血凝抑制抗体效价从2013.4-2014.3主要集中在640-1280，到2014.4-2015.3为160-640，再到2015.4-2015.9为80-320（图3）；B型毒株的血凝抑制抗体效价一直在1280或以上；新甲流H1N1病毒只在2013.4-2014.3年出现过，血凝抑制效价320-1280（图3）。三年内均未检测到季节性A (H1N1)流感病毒。

3　讨论

图1　景德镇市2013- 2015年不同月份流感病毒分离情况

图2　景德镇市2013.4- 2015.9流感样病例核酸检测情况

图3　毒株鉴定-血凝抑制抗体效价分布图

表1　景德镇市2013.4- 2015.9流感核酸检测结果

表2　景德镇市2013.4- 2015.9不同型别（亚型）流感病毒核酸阳性标本病毒分离结果

流感病毒按H和N抗原差异，H可分为15个亚型（H1-15），N有9个亚型（N1-9）.同型病毒又分若干亚型。抗原变异是流感病毒独特的和最显著的特征。正是由于这种不断发生的抗原变异而导致流感的反复流行。流感病毒的抗原性变异是指H和N抗原结构的改变，主要是H。甲型流感病毒极易发生抗原变异，2～3年可发生一次，乙型流感病毒的抗原变异很慢。一般新旧亚型之间有明显的交替现象，在新的亚型出现并流行到一个地区后，旧的亚型就不再能分离到。

本实验室于2009年新甲流大流行期间加入国家流感监测网络，因加入网络实验室的时间较晚，病毒分离工作更晚一些。本次对景德镇市2013.4-2015.9的完整监测数据进行研究[2-4]，发现本地区近3年来流感病毒总体流行特点如下：

⑴流行亚型多样化，2013年4月-2014年3月表现为季节性A(H3N2)、新甲型H1N1、B型交替出现，并且2013年12月到2014年1月两个月内同时出现三种流感病毒。结合2009年8月-2015 年9月的核酸检测结果发现：新甲型H1N1在2009年大量暴发病例后由于人为接种新甲型H1N1疫苗后，2010年4月以后新甲型H1N1的发病率直线下降(数据为列出)，经过三年左右的时间新甲型H1N1于2013年4月又开始出现并于当年的冬季短暂大量的出现，随后的两年新甲型H1N1在监测样品中不再检出，并且流感优势株从新甲型H1N1转变为A（H3N2）。提示下个监测周期可能会有新甲型H1N1的出现。2014年4月-2015年9月主要以季节性A(H3N2)为优势流感株高发于夏季6-8月，冬春季以B(Yamagata)型为主，与本省其它地区流行趋势一致[5-7]，提示下个监测周期B （Victoria）型可能会成为B型流感的优势株。

⑵景德镇市地处江西东北部，属于亚热带地区气候，流感则更多是在夏季流行。根据上述监测情况发现本地区的流感高发期主要集中在夏季6-8月，因此本地区现阶段具有流感季节性流行特点，不大可能发生流感大流行[8]。本地区3年内从未检出过季节性H1N1流感，人群对此类病毒缺乏免疫可能造成大面积流感暴发需要引起足够重视。

⑶通过病毒分离发现，季节性A(H3N2)的分离率从85.70%下降到59.02%，呈逐年下降，MDCK细胞对B型流感的分离率逐年上升，并到达最高90.91%分离率，提示MDCK细胞对季节性A (H3N2)病毒的敏感性降低，或者A(H3N2)病毒对MDCK细胞攻击性降低，应加强分析，探索分离率提高的方法。

⑷血凝抑制实验发现，A(H3N2)的血凝抑制抗体效价也从1280降到最低40；B型流感血凝抑制抗体效价都在1280或以上。通过上述数据，我们发现季节性A(H3N2)抗原性正在逐年发生明显变化，而B型流感的抗原性变化较慢，与相关研究文献结果一致[9，10]。

因此对既往流感监测数据的分析可以帮助我们更好的了解流感在本地区的流行趋势；开展流感监测能够第一时间发现其他型别的流感病毒，减少此类流感病毒在人群中的传播具有重要意义。

参考文献

[1]中华人民共和国卫生部.全国流感监测方案(2010年版)[S].2010.

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