奥拉西坦对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后RGMa的表达①

丁兰兰，王显鹤，刘喜凤，杨占双，吴祥红，王　娇，聂　影

(1.佳木斯大学，黑龙江佳木斯154007; 2.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江佳木斯154003)



奥拉西坦对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后RGMa的表达①

丁兰兰1，王显鹤2，刘喜凤1，杨占双2，吴祥红2，王娇2，聂影2

(1.佳木斯大学，黑龙江佳木斯154007; 2.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江佳木斯154003)

摘要:目的:通过建立新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(Hypoxic－－ischemic brain damage，HIBD)模型，检测HIBD大鼠脑组织中排斥导向因子A(RGMa)的表达变化，探讨奥拉西坦对HIBD大鼠RGMa表达的影及其对神经损伤的修复及保护作用。方法:将135只新生7d龄Wistar大鼠随机分为假手术组(sham组，45只)，缺氧缺血组(HIBD组，45只)和奥拉西坦治疗组(45 只)，每组分为12h、24h、48h、72h、7d五个亚组。sham组只做左侧颈总动脉分离，不做缺氧处理，HIBD组及奥拉西坦组做左侧颈总动脉结扎及缺氧处理，分别于术后腹腔注射生理盐水0.1mL/kg和奥拉西坦100mg/kg，分别于术后12h、24 h、48 h、72 h、7d断颈处死大鼠。免疫组化检测皮质及海马中RGMa表达。结果: sham组，可见RGMa有微量表达，各组间无统计学意义; HIBD组: RGMa阳性细胞在造模12h开始表达，24h升高，48h达高峰，此后逐渐降低，与sham组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，奥拉西坦治疗组各时间点RGMa表达均低HIBD组，差异有统计学意义(P＜0.05)，HIBD组和奥拉西坦治疗组阳性细胞数均多于sham组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。结论: HIBD时脑组织中RGMa表达增多，参与脑损伤，奥拉西坦能通过抑制RGMa大量表达从而促进受损神经的再生与修复。

关键词:缺氧缺血性脑损伤;奥拉西坦; RGMa

HIBD是新生儿窒息后产生的一种严重并发症，迄今仍是导致新生儿死亡和永久性神经系统后遗症的原因。HIBD后中枢神经系统(CNS)损伤后神经元再生困难，主要是因为轴突生长抑制因子妨碍了受损神经的的再生，RGMa(Repulsive guidance molecule )是一种新的具有排斥及诱导生长锥塌陷的轴突再生抑制蛋白。本课题是利用新生大鼠HIBD模型来探奥拉西坦对RGMa的影响及其对神经再生的促进作用。

1　材料与方法

1.1材料

清洁级7d龄Wistar新生大鼠，体重(12.5± 3) g，雌雄不限，均由佳木斯大学动物实验中心提供，奥拉西坦注射液购自哈尔滨三联药业股份有限公司，RGMa购自北京博奥森生物工程有限公司，免疫组化试剂盒，DAB显示剂购于武汉博士德生物工程有限公司;混合气体(氮气: 920mL/L，氧气: 80mL/L) :佳木斯市金鼎氧气。

1.2分组与造模

将135只新生7d龄Wistar大鼠按随机数字表法分3组，假手术组(sham组)，缺氧缺血组(HIBD 组)，奥拉西坦治疗组，每组45只，每组再分为12h、24h、48h、72h、7d六个亚组。Sham组只做左侧颈总动脉分离，不做结扎。HIBD组和奥拉西坦组参照Rice法建立HIBD模型，新生鼠乙醚吸入麻醉，仰卧胶布固定于手术板上，常规酒精消毒。于颈部正中纵行切口，用玻璃分针钝性分离皮下组织和肌肉，游离并暴露左侧颈总动脉后，用4－0号线结扎，缝合切口，碘伏消毒局部皮肤后，返回母鼠身边恢复1h后，置于自制37°恒温缺氧仓内，以2L/min的速度输入含92%氮气和8%氧气的混合气体，持续2h。HIBD组和奥拉西坦组分别于术后10min腹腔注射生理盐水0.1mL/kg和奥拉西坦100mg/kg，之后每日一次，分别与12h、24h、48h、72h、7d断颈处死。

1.3取材

三组均与造模后12h、24h、48h、72h、7d各处死9只大鼠，心脏灌注后断头取全脑，并立即将脑组织保存于4%的多聚甲醛0.1mol/L PBS的(pH 7.4)溶液中，固定72h以上。之后把固定的鼠脑从视交叉后2～6mm处做脑组织的冠状切面，取其脑组织脱水石蜡包埋。用石蜡切片机将蜡块连续切片，片厚约3μm，每5张取一张片作免疫组织化学，取部分做HE染色。

1.4脑组织病理形态

HE染色法观察新生大鼠各时间点脑组织形态变化。

1.5 RGMa免疫组化染色

各组各时间点的脑组织切片分别用兔抗RGMa抗体作为一抗，二抗为生物素化山羊抗兔IgG，以PBS代替一抗作为对照。RGMa阳性为胞质染成浅黄色、棕黄色或者棕褐色.采用阳性细胞计数法，每张切片分别随机选取海马及皮质6个不重叠视野(×400)，在同一光强度下，计数RGMa阳性细胞数，计算阳性细胞数百分比，取平均值。

1.6统计学方法

采用SPSS.17.0软件进行统计学分析。对各组的数据给予正态性检验和方差齐性检验比较各组数据均数，进行单因素方差，用均数±标准差表示，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2　结果

2.1肉眼观察大鼠脑组织形态

sham组大鼠脑组织形态正常，HIBD组随造模时间延长，可见左侧大脑出现水肿、坏死病灶，结扎侧的脑半球形态发生改变。而奥拉西坦治疗组脑组织水肿程度较HIBD组轻，未见液化坏死灶。

2.2脑组织病理变化

sham组脑组织各部位形态结构清晰，细胞层次清楚，形态正常。HIBD组随着造模时间延长，依次出现细胞肿胀、神经元排列紊乱、细胞核固缩、碎裂及坏死灶周围炎性细胞增多。奥拉西坦治疗组各时间点细胞肿胀及核固缩、碎裂溶解的细胞数均少于HIBD组。

2.3 RGMa表达

在sham组可见少量RGMa阳性细胞; HIBD组RGMa阳性细胞数于造模12h后可见棕黄色阳性表达，24h表达升高，至48h达高峰，之后维持高浓度，较前逐渐下降。奥拉西坦治疗组RGMa阳性细胞表达部位及变化规律与HIBD组相似，阳性细胞数在各时间点的表达均低于HIBD组，与HIBD组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，与sham组比较，HIBD组和奥拉西坦治疗组阳性细胞数均多于sham组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。见表1，图1。

表1　各组不同时间点RGMa阳性细胞数(%)比较(±s，n =9)

表1　各组不同时间点RGMa阳性细胞数(%)比较(±s，n =9)

注:与sham组比较，aP＜0.05，b与HIBD组比较P＜0.05。

组别12h　24h　48h　72h　7d sham组　6.00±2.57　6.17±2.38　6.73±2.88　6.59±2.41　6.96±2.43 HIBD组　26.47±2.90a　32.28±5.91a　58.59±6.51a　51.30±5.94a　40.40±5.45a奥拉西坦组　22.28±3.00ab　27.74±5.63ab　52.42±6.40ab　40.76±5.80ab　28.44±3.32abF值　265.67　145.49　473.14　394.34　332.48 P ＜0.05　　＜0.05　　＜0.05　　＜0.05　　＜0.05

图1　sham组、HIBD组、奥拉西坦治疗组大鼠大脑皮质不同时间点RGMa表达(免疫组织化学染色×200)

3　讨论

HIBD是由多种原因引起的脑缺氧和(或)脑缺血性损伤，可引起新生儿围生期脑损伤和长期神经系统的严重后遗症，其后遗症的发生与神经再生障碍关系密切。CNS损伤后神经再生修复能力，不仅与神经元自身的再生能力有关，还受神经元所处的生存环境中的各种外源性的生长促进因子和抑制性因子的共同影响。近年来研究比较多的RGMa蛋白，是一种排斥性轴突导向分子，可存在于脉络丛、成熟髓磷脂和正形成的瘢痕等干扰轴突生长的结构中，通过与其受体Neogenin结合，激活RhoA－Rho激酶信号转导途径，使神经元轴索内细胞骨架重排、生长锥塌陷，并最终导致神经元凋亡、再生“流产”［1］。在本研究中，我们以新生7d龄Wistar大鼠为对象建立HIBD模型，观察当发生缺氧缺血性脑损伤时RGMa的表达变化来评估轴突损伤及再生情况。在sham组，在新生大鼠的海马区、大脑皮层的神经元及胶质细胞可见RGMa阳性细胞表达，表明RGMa存在于正常的脑组织中，并且可能参与了中枢神经系统的发育和生长调控。HIBD组，12h可见RGMa阳性细胞表达，24h升高，于48h达高峰，之后维持高浓度，并较前逐渐降低。由此推测RGMa在脑损伤急性期表达增加，抑制轴突再生，并且当RGMa达峰值时，其对轴突再生的抑制最大，随着RGMa的降低，其对轴突的抑制作用逐渐降低。奥拉西坦可以选择性的作用于大脑皮层和海马，能够改善脑水肿，保护受损细胞，激活和促进神经细胞功能的恢复，是一种新的中枢神经系统益智药。张洋［2］等通过实验证明奥拉西坦可以改善新生大鼠HIBD模型脑水肿。多项临床实践［3～5］证明奥拉西坦在治疗脑卒中，老年痴呆，脑梗死等取得了很好的治疗效果。有研究［6］将奥拉西坦应用于新生儿缺氧缺血性脑病，取得了良好的治疗效果。国外学者［7］通过研究表明，在大鼠脊髓损伤模型中，使用RGMa特异性抗体后，结果表明RGMa抗体能够综合RGM，促进轴突生长。Feng J等［8］通过实验证实，在大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型中RGMa蛋白在缺血侧皮质及海马升高，通过给予RGMa特异性RNAi后可显著促进轴突再生，改善大鼠的神经功能。近年来多项研究［9～12］表明，通过给予药物干预，可促使RGMa表达下调，从而促进神经再生。本实验结果表明奥拉西坦治疗组无论在肉眼观察大鼠的脑体形态，还是HE染色结果均显示，应用奥拉西坦后脑组织的损伤程度均低于HIBD组;免疫组化结果显示奥拉西坦组RGMa阳性细胞数在各个时间点均低于HIBD组，提示给予奥拉西坦后可能抑制RGMa的表达。目前未见有关奥拉西坦在HIBD中对RGMa的影响的报道。综上所述，在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的试验中，奥拉西坦可能通过下调RGMa的表达，促进轴突再生和修复。但是奥拉西坦下调RGMa的机制目前尚不清楚，这需要我们今后进一步探索。

参考文献:

［1］ChakrabortyG，Jain S，Kundu GC，et al.Osteopontin promotes vascular endothelial growth factor－dependent breast tumor growth and angiogenesis via autocrine and paracrine mechanisms［J］.Cancer Res，2008，68(1) : 152－161

［2］张洋，白莉，顾镜月，等.奥拉西坦对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后AQP－4表达的影响［J］.黑龙江医药科学，2015，38(3) : 80－81

［3］马小琦.奥拉西坦治疗卒中后认知功能障碍患者的疗效观察［J］.中国民康医学2015，27(19) : 59－60

［4］杨学东.奥拉西坦在老年性痴呆治疗中的疗效探讨［J］.中外医疗，2015(29) : 124－125

［5］闫静.奥拉西坦对脑梗死恢复期患者轻度认知功能障碍的影响分析［J］.中国疗养医学，2015，24(9) : 969－970

［6］郑志红.奥拉西坦注射液治疗新生儿缺氧缺血性脑病疗效观察［J］.中国社区医师，2012，29(14) : 110

［7］Hata K，Fujitani M，Yasuda Y，et al.RGMa inhibition promotes axonal growth and recovery after spinal cord injury［J］.J Cell Biol，2006，173(1) : 47－58

［8］Feng J，Wang T，Li Q，et al.RNA interference against repulsive guidance molecule A improves axon sprout and neural function recovery of rats after MCAO/reperfusion［J］.Exp Neurol，2012，238(2) : 235－242

［9］Kitayama M，Ueno M，Itakura T，et al.Activated microglia inhibit axonal growth through RGMa［J］.PLoS One，2011，6(9) : 25234

［10］赵旭，薛承景，李雪，等.丁基苯酞对大鼠弥漫性脑损伤后排斥性导向分子表达的影响［J］.中国煤炭工业医学杂志，2015，18 (2) : 284－288

［11］陶涛，秦新月，冯金洲.低剂量米诺环素对脑缺血再灌注大鼠RGMa表达的影响［J］.中国神经精神疾病杂志，2015，41(3) : 141－144

［12］陶涛，秦新月，徐广会.养血清脑颗粒对大鼠脑缺血再灌注损伤后轴突再生及RGMa表达的影响［J］.第三军医大学学报，2013，35(7) : 635－638

(收稿日期:2015－12－18)

通讯作者:王显鹤(1966～)女，黑龙江佳木斯人，硕士，主任医师，副教授，硕士研究生导师。E－mail: 312037443@ qq.com。

作者简介:丁兰兰(1990～)女，山东济宁人，在读硕士研究生。

基金项目:①1.佳木斯大学研究生科技创新项目，编号: LM2015_024 ; 2.佳木斯大学科学技术校级面上项目，编号: S2014－008。

中图分类号:R743

文献标识码:A

文章编号:1008－0104(2016) 02－0018－03