急性髓系白血病患者骨髓单个核细胞FANCD2表达及意义

邓娜，娄晔，于一冰，王晓鸥，樊华

(1中国医科大学附属第四医院，沈阳110032；2大庆市油田总医院；3秦皇岛市第一医院)

急性髓系白血病患者骨髓单个核细胞FANCD2表达及意义

邓娜1，娄晔2，于一冰3，王晓鸥1，樊华1

(1中国医科大学附属第四医院，沈阳110032；2大庆市油田总医院；3秦皇岛市第一医院)

目的 探讨急性髓系白血病(AML)患者骨髓单个核细胞范可尼贫血互补群蛋白质D2(FANCD2)表达及意义。方法 选择AML患者111例，其中初诊64例、完全缓解27例、复发20例；另选缺铁性贫血患者28例、血小板减少性紫癜患者14例作为对照组。患者均于入院时抽取骨髓，提取骨髓单个核细胞，采用Western blotting法检测骨髓单个核细胞FANCD2表达。分析骨髓单个核细胞FANCD2的相对表达量与AML患者性别、年龄、AML分型的关系。结果 初诊AML患者骨髓单个核细胞FANCD2的相对表达量为0.477±0.127，完全缓解AML患者为1.284±0.067，复发AML患者为0.410±0.026，对照组为1.352±0.066；初诊及复发AML患者骨髓单个核细胞FANCD2的相对表达量均低于对照组(P均<0.05)，其余组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。AML患者骨髓单个核细胞FANCD2的相对表达量与性别、年龄、AML分型均无关(P均>0.05)。结论 AML患者骨髓单个核细胞FANCD2表达降低，FANCD2表达降低或缺失可能参与AML的发病及复发。

急性髓系白血病；范可尼贫血互补群蛋白质D；骨髓单个核细胞

范可尼贫血(FA)是一种常染色体隐性遗传病，以染色体不稳定且高度易患急性髓系白血病(AML)[1]、头颈部鳞状细胞癌、妇科肿瘤等为特征。FA的发病机制为基因表达异常所致FA/BRCA通路失活，导致DNA损伤修复功能缺陷[2～5]。范可尼贫血互补群蛋白质D2(FANCD2)是FA/BRCA通路中的关键蛋白，其表达异常与乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌等多种肿瘤的发病有关，但FANCD2表达变化与AML关系的研究鲜见报道。本研究探讨AML患者骨髓单个核细胞FANCD2的表达变化及意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2007年9月～2015年7月中国医科大学附属第一医院和第四医院收治的AML患者111例(AML组)，男62例、女49例，年龄19～78岁、中位年龄56岁，AML分型：M1型5例、M2型28例、M3型35例、M4型10例、M5型25例、M6型8例；初诊64例，完全缓解27例、复发20例。AML缓解和复发均符合骨髓细胞形态学(M)、细胞免疫学(I)、细胞遗传学(C)和分子生物学(M)标准，即MICM标准。同期另选缺铁性贫血患者28例、血小板减少性紫癜患者14例作为对照组，男24例、女18例，年龄25～72岁、中位年龄54岁。两组性别、年龄具有可比性。

1.2 骨髓单个核细胞FANCD2表达检测 采用Western blotting法。两组均于入院时选择髂前或髂后上棘作为穿刺点，常规方法抽取骨髓3～5 mL，肝素抗凝；缓慢注入4 mL淋巴细胞分离液，2 100 r/min离心20 min；取中间细胞层，PBS洗涤(1 500 r/min离心5 min)，弃上清；加入蒸馏水2 mL作用1 min，再加入1.8% NaCl 2 mL，1 500 r/min离心5 min，弃上清液；留取1×106个单个核细胞(约50 μL细胞沉淀)，-80 ℃冰箱冻存。将提取的骨髓单个核细胞在RIPA-buffer蛋白裂解液中裂解，超声破碎细胞，4 ℃、12 000 r/min离心20 min，取上清液，采用分光光度计检测FANCD2表达；取25 μg置于10% SDS-PAGE凝胶上电泳；将电泳产物转移至PVDF膜上，加入兔抗人FANCD2一抗，4 ℃孵育过夜；加入山羊抗兔二抗，显影剂显影。以β-actin为内参。采用GTS图像分析系统扫描目的条带，以校正值K对目的条带灰度值进行半定量分析。K=FANCD2条带灰度值/β-actin条带灰度值。并分析骨髓单个核细胞FANCD2的相对表达量与AML患者性别、年龄、AML分型的关系。

2 结果

初诊AML患者骨髓单个核细胞FANCD2的相对表达量为0.477±0.127，完全缓解AML患者为1.284±0.067，复发AML患者为0.410±0.026，对照组为1.352±0.066；初诊及复发AML患者骨髓单个核细胞FANCD2的相对表达量均低于对照组(P均<0.05)，其余组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。AML患者骨髓单个核细胞FANCD2的相对表达量与性别、年龄、AML分型均无关(P均>0.05)，见表1。

表1 骨髓单个核细胞FANCD2的相对表达量与AML患者性别、年龄、AML分型的关系

3 讨论

FANCD2基因定位于3p25.3，有44个外显子，编码两种均含有1 451个氨基酸的蛋白质(FANCD2-S和FANCD2-L)，两种蛋白质通过化学修饰可实现相互转换。FANCD2作为FA/BRCA通路的关键基因，是FA/BRCA通路激活的标志。FANCD2的主要功能是参与细胞周期调控、细胞凋亡、DNA损伤修复及维持染色体和基因组稳定。当细胞DNA受到损伤或处于细胞周期S期时，FANCD2在上游FA/BRCA通路核心复合体的作用下发生单泛素化，转位至细胞核DNA损伤部位，进而招募更多的 DNA 修复蛋白，参与DNA损伤修复过程[6]。基因突变、microRNA序列变异等多种因素均可调控FANCD2的泛素化及表达[7]，当FANCD2低表达或功能缺失时，FA/BRCA通路的正常功能受损，细胞失去保护机制，导致细胞染色体不稳定，最终引起肿瘤的发生。

目前已在多种实体肿瘤中证实，FANCD2蛋白低表达或功能缺失与肿瘤的发生、发展及患者预后相关[8,9]。FANCD2在乳腺癌中的研究较多，10%～20%的乳腺癌细胞中 FANCD2表达缺失[10]；Zhang等[11]发现，乳腺癌组织FANCD2阳性细胞表达率明显低于正常乳腺组织，且部分侵袭性乳腺癌中FANCD2表达缺失。但也有报道称，FANCD2基因在卵巢癌早期高表达，Ⅲ期低表达，推测可能临界肿瘤在恶性转化过程中激活了相关 DNA 修复和维持基因组稳定的基因，进而导致这些基因表达上调[12]。有研究还发现，FANCD2在正常肺组织中不表达，在非小细胞肺癌组织中可见表达，但表达量与肿瘤分期无关[13]。FANCD2在不同组织中表达不同，可能与组织特异性、样本量、种族或检测方法不同有关。

本研究以AML初诊、复发及完全缓解患者为研究对象，并选取缺铁性贫血和血小板减少性紫癜患者作为对照组。因健康成年人的骨髓难以得到，临床研究获取其骨髓不符合伦理学要求，缺铁性贫血和血小板减少患者临床常规进行骨髓检查，且二者骨髓各阶段造血细胞比例与正常个体大致相同，因此选择二者作为对照。结果显示，对照组及AML完全缓解患者骨髓单个核细胞FANCD2的相对表达量均高于AML初诊和复发患者，提示FANCD2低表达参与了AML的发生及复发。其机制可能为FANCD2表达降低或缺失可能使下游FANCD2单泛素化缺失，FA/BRCA通路缺陷，导致DNA修复能力下降，细胞的保护机制逐渐丧失，使细胞抵御外来损害的能力下降。本研究还发现，AML患者骨髓单个核细胞FANCD2的相对表达量与性别、年龄及AML分型均无关，可能与本研究病例数较少、研究方法单一有关，确切结果及具体机制有待进一步研究。

总之，AML患者骨髓单个核细胞FANCD2表达降低，FANCD2表达降低或缺失可能与AML的发病及复发有关。

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辽宁省科技厅资助项目(2013225021)。

樊华(E-mail： fanhua66@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.24.030

R733.71

B

1002-266X(2016)24-0079-03

2016-01-12)