鼠妇水提取物和乙酸乙酯提取物对骨桥蛋白诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响及机制

段哲萍，于新江，吴大勇，李菁菁，赵娟

(1河北省人民医院，石家庄050051；2河北医科大学)

鼠妇水提取物和乙酸乙酯提取物对骨桥蛋白诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响及机制

段哲萍1，于新江1，吴大勇1，李菁菁2，赵娟2

(1河北省人民医院，石家庄050051；2河北医科大学)

目的 观察鼠妇水提取物和乙酸乙酯提取物对骨桥蛋白(OPN)诱导的血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响，探讨其作用机制。方法 采用常规贴块法分离培养SD大鼠VSMC，收集对数生长期的第3～5代细胞随机分为14组，对照组常规培养，OPN组加入终浓度为20 mg/mL的OPN，鼠妇水提取物高、中、低剂量组分别加入终浓度为2、1、0.5 mg/mL的鼠妇水提取物，鼠妇乙酸乙酯提取物高、中、低剂量组分别加入终浓度为1、0.5、0.25 mg/mL的鼠妇乙酸乙酯提取物，OPN+鼠妇水提取物高、中、低剂量组分别加入终浓度为20 mg/mL的OPN及终浓度为2、1、0.5 mg/mL的鼠妇水提取物，OPN+鼠妇乙酸乙酯提取物高、中、低剂量组分别加入终浓度为20 mg/mL的OPN及终浓度为1、0.5、0.25 mg/mL的鼠妇乙酸乙酯提取物，各组均培养24 h；采用MTT法检测细胞增殖情况(OD值)，采用Western boltting法检测细胞FAK蛋白相对表达量。结果 OPN组OD值及FAK蛋白相对表达量均高于其他各组(P均<0.05)；OPN+各浓度鼠妇水提取物及OPN+各浓度鼠妇乙酸乙酯提取物组OD值及FAK蛋白相对表达量均低于OPN组(P均<0.05)，各浓度组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论 鼠妇水提取物和乙酸乙酯提取物对OPN诱导的VSMC增殖均具有抑制作用，抑制FAK胞内信号传导可能是二者共同的作用机制。

鼠妇水提取物；鼠妇乙酸乙酯提取物；骨桥蛋白；血管平滑肌细胞增殖；黏着斑激酶

血管平滑肌细胞(VSMC)向血管内膜下迁移、增殖，同时释放细胞外基质(ECM)是多种血管重塑性疾病，如动脉粥样硬化、高血压等的细胞病理学基础。骨桥蛋白(OPN)可以诱导VSMC的增殖和迁移过程，黏着斑激酶(FAK)在这一过程中发挥重要作用[1]。鼠妇为无脊椎动物节肢动物门甲壳纲潮虫亚目的俗称，具有解毒、止痛、平喘、破血、利尿、通经等作用[2～6]，但其对VSMC增殖的影响未见报道。2015年6～10月，本研究观察了鼠妇水提取物和乙酸乙酯提取物对OPN诱导的VSMC增殖的影响，现分析结果并探讨其作用机制。

1 材料、方法与结果

1.1 材料 雄性SD大鼠1只，体质量90～100 g，购自河北医科大学实验动物中心。DMEM培养基、胎牛血清购自Gibco公司；β-actin多抗、小鼠抗FAK单抗(sc-20019)和化学发光试剂盒购自Santa Cruz公司；重组鼠OPN购自Sigma公司；鼠妇水提取物及鼠妇乙酸乙酯提取物由河北中医学院药学院制备、鉴定并测定浓度。

1.2 VSMC分离及培养 采用常规贴块法分离培养SD大鼠VSMC。SD大鼠腹腔注射25%乌来糖2 mL行全身麻醉，取主动脉弓至腹主动脉分叉处血管离断，放入含10%胎牛血清的DMEM培养基，去除血管周围脂肪及管腔内残留血液；清洗后的血管转移到新的含10%胎牛血清的DMEM培养基，纵向剪开血管，将血管壁剪成小于1.0 mm×1.0 mm的小片；将剪好的血管壁小片分成3份，分别贴于干净的小培养瓶中，倒置于37 ℃、5% CO2培养箱中，在含10%胎牛血清的DMEM培养液中培养2～3 h，使贴片稳固贴于培养瓶；倒转小培养瓶，使培养液充分浸润贴壁的血管小片，定期在显微镜下观察细胞生长状况；2～3天更换培养液，5～7天将原代细胞经胰酶消化后进行传代。

1.3 鼠妇对VSMC增殖能力的影响 收集对数生长期的第3～5代VSMC，调整细胞悬液浓度为5×104/mL，包埋于96孔板，随机分为14组，对照组细胞常规培养，OPN组细胞加入终浓度为20 mg/mL的OPN，鼠妇水提物高、中、低剂量组分别加入终浓度为2、1、0.5 mg/mL的鼠妇水提取物，鼠妇乙酸乙酯提取物高、中、低剂量组分别加入终浓度为1、0.5、0.25 mg/mL的鼠妇乙酸乙酯提取物，OPN+鼠妇水提取物高、中、低剂量组分别加入终浓度为20 mg/mL的OPN及终浓度为2、1、0.5 mg/mL的鼠妇水提取物，OPN+鼠妇乙酸乙酯提取物高、中、低剂量组分别加入终浓度为20 mg/mL的OPN及终浓度为1、0.5、0.25 mg/mL的鼠妇乙酸乙酯提取物；各组均于37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h；采用MTT法检测细胞增殖情况，步骤参照试剂盒说明书。将各孔细胞置于酶联免疫检测仪，检测490 nm波长处各孔吸光度值(OD值)。结果显示，OPN组OD值高于其他各组(P均<0.05)；各浓度鼠妇水提取物及鼠妇乙酸乙酯提取物组OD值与对照组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；OPN+各浓度鼠妇水提取物及OPN+各浓度鼠妇乙酸乙酯提取物+OPN组OD值均高于对照组(P均<0.05)、均低于OPN组(P均<0.05)；其余组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

1.4 鼠妇对VSMC FAK蛋白表达的影响 采用Western blotting法。采用RIPA裂解液提取1.3中对照组，OPN组，OPN+鼠妇水提取物高、中、低剂量组，OPN+鼠妇乙酸乙酯提取物高、中、低剂量组，培养24 h的细胞总蛋白，用BCA法测定各组蛋白浓度。每组取80 g蛋白进行SDS-PAGE电泳，PVDF转膜，5%脱脂奶粉封闭，与特异性FAK一抗(1∶3 000)4 ℃孵育过夜，TTBS洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的IgG(1∶5 000)室温孵育 1 h，洗膜后采用ECL化学发光法行电泳蛋白条带显影，凝胶图像分析系统记录每组数据，测量各组条带积分光密度值，与对应的β-actin积分光密度值进行比值，作为目的蛋白的相对表达量。结果显示，OPN组FAK蛋白相对表达量均高于其他各组(P均<0.05)；OPN+各浓度鼠妇水提取物组及OPN+各浓度鼠妇乙酸乙酯提取物组FAK蛋白相对表达量均低于OPN组(P均<0.05)，各浓度组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 各组细胞增殖情况及FAK蛋白相对表达量比较±s)

注：与对照组比较，*P<0.05；与OPN组比较，△P<0.05。

2 讨论

VSMC的黏附、增殖和迁移等过程均有ECM成分参与，如纤连蛋白(FN)、OPN和多种生长因子等。细胞生物学研究证实，细胞黏附、铺展及迁移是一系列精确周密的周期性动态发展过程，受多种胞内信号传导系统的综合调控，各条传导通路之间相互作用、相互交叉。研究发现，ECM介导的整合素信号通路参与细胞的黏附、迁移过程[7]。整合素是一种跨膜受体，是由α和β两个亚单位组成的异源二聚受体。VSMC表达整合素αvβ3，结合配体包括FN、OPN和玻连蛋白(VN)等。但是，整合素自身并不具有激酶活性，需经由β亚单位胞内区与FAK、整合素连接激酶(ILK)、talin及paxillin等相互作用后将其募集到胞膜内侧，共同组成黏着斑复合物，由此启动多条信号转导通路，引起VSMC的黏附和迁移，参与细胞骨架的重组，完成血管炎性增生和血管重塑等复杂过程[8,9]。

现代研究发现，鼠妇的主要药理成分为蛋白质、糖原、还原糖、黏多糖等多种饱和及不饱和脂肪酸。动物研究发现，鼠妇可治疗小鼠心律失常，对其具有镇痛、抗炎等作用。临床亦有用鼠妇治疗慢性喘息性气管炎、骨质增生、寻常疣、口腔炎、癌痛、手术后疼痛等报道[2～6]。目前中药有效成分的提取方法主要包括蒸馏法、酶提取法、酸碱法等，提取时主要采用葡萄糖、乙醇、水、乙酸乙酯、氯仿等有机溶剂。但不同提取方法、不同提取溶剂、甚至不同浓度的同一种溶剂，提取回收率和有效成分含量存在极大差异[10,11]。本课题组前期研究发现，鼠妇水提取物及乙酸乙酯提取物对VSMC凋亡均无影响，本研究结果显示二者单独使用对VSMC增殖无明显影响，说明这两种鼠妇提取物对于正常生长的细胞是安全无害的；本研究亦发现，同时给予OPN和鼠妇水提取物或乙酸乙酯提取物，则这两种提取物均可发挥抑制细胞增殖的作用。由于两种方法所提取的有效成分不同，故乙酸乙酯提取物随浓度增高表现出对OPN刺激VSMC增殖的抑制作用愈强，而鼠妇水提取物随浓度增高表现为对OPN刺激VSMC增殖的抑制作用愈弱，但组间比较差异均无统计学意义。

FAK是一种非受体型酪氨酸激酶，是细胞内诸多信号传导途径的汇合点，参与细胞的迁移、黏附、铺展、增殖和凋亡等过程[12]。在与细胞增殖等密切相关的众多疾病(如心血管病、纤维类疾病、恶性肿瘤等)的病理发展过程中，FAK发挥至关重要的分子生物学作用。在血管再狭窄类疾病的发生、发展过程中，FAK的活化及表达均显著增加，且FAK蛋白表达增加的程度与新生血管内膜过度增生水平密切相关，提示FAK的活化和高表达促进VSMC增殖。本课题组前期研究发现，OPN与位于VSMC表面的整合素相互作用，激活细胞内的FAK信号分子，促进细胞增殖、迁移[13，14]。本研究结果显示，OPN可促进VSMC中FAK蛋白表达，鼠妇乙酸乙酯提取物和水提取物均可抑制OPN的上述作用；提示两种鼠妇提取物可能均通过抑制FAK胞内信号传导系统而抑制VSMC的增殖。

总之，鼠妇水提取物和乙酸乙酯提取物对OPN诱导的VSMC增殖均具有抑制作用，抑制FAK胞内信号传导可能是其共同作用机制。

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