基于Nrf2信号通路的三七总皂苷对Aβ25－35诱导PC12细胞凋亡的保护作用机制研究

赵静宇，汪梦霞，赵自明，孟祥宝，孙桂波，孙晓波

［1.广州中医药大学附属广东省第二中医院，广东广州 510405；2.广东省中医药工程技术研究院，广东省中医药研究开发重点实验室，广东广州 510095，3.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，中药（天然产物）创新药物研发北京市重点实验室，北京 100193］

基于Nrf2信号通路的三七总皂苷对Aβ25－35诱导PC12细胞凋亡的保护作用机制研究

赵静宇1，2，汪梦霞1，2，赵自明2，孟祥宝3，孙桂波3，孙晓波3

［1.广州中医药大学附属广东省第二中医院，广东广州 510405；2.广东省中医药工程技术研究院，广东省中医药研究开发重点实验室，广东广州 510095，3.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，中药（天然产物）创新药物研发北京市重点实验室，北京 100193］

目的 探讨三七总皂苷对Aβ25－35诱导的PC12细胞凋亡的保护作用及分子机制。方法 利用Aβ25－35诱导PC12细胞损伤模型，MTT法检测PC12细胞活力，试剂盒测定LDH漏出量、ROS水平、MDA含量、Caspase-3活力以及抗氧化酶SOD、CAT和GHS-Px活力，TUNEL染色检测细胞凋亡，JC-1染色观察线粒体膜电位，Western blot检测相关蛋白HO-1、Lamin-B、细胞核内Nrf2及总Nrf2的蛋白表达。结果三七总皂苷能够明显抑制Aβ25－35诱导的PC12细胞活力下降（P＜0.01）和LDH漏出（P＜0.01），减少ROS和MDA的产生（P＜0.01），增加SOD、CAT和GSH-Px活力（P＜0.01），稳定线粒体膜电位，抑制caspase-3的活化（P＜0.01）。而且，三七总皂苷还能够上调PC12细胞细胞核Nrf2、总Nrf2和细胞质中HO-1的蛋白表达。HO-1抑制剂SnPP能够抑制三七总皂苷的神经保护作用。结论 三七总皂苷可能通过上调Nrf2/HO-1信号通路，从而抑制Aβ25－35诱导PC12细胞氧化应激和凋亡。

阿尔茨海默病；三七总皂苷；氧化应激；凋亡；Nrf2；HO-1

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种最常见的老年痴呆症。目前全球大约有3 500万患者，已成为继心血管疾病和肿瘤之后，严重影响人类健康的第3位因素［1－2］。随着人口老龄化的加剧，AD的发病率也逐年上升，给患者本身及其家庭和社会造成了沉重的经济负担。因此，开发具有防治AD作用的药物迫在眉睫。

AD的主要病理特征是β淀粉样蛋白细胞外沉积形成的老年斑、细胞内过度磷酸化的Tau蛋白为核心形成的神经原纤维缠结以及神经元的丢失［3］。尽管国内外学者对AD的研究有了很大进步，但AD的具体发病机制目前还不清楚。近年来的研究发现，氧化应激和凋亡促进了AD的发生发展［4］。因此，深入研究药物抗AD的作用靶点和分子机制，对AD的防治具有重要意义。

细胞自身为应对氧化应激启动了很多保护性机制，包括抗氧化剂和内源性抗氧化酶系统。其中抗氧化酶包括HO-1、SOD、CAT和GSH-Px等。药物诱导这些抗氧化酶表达能够增强神经细胞对氧化应激的抵抗能力。这些抗氧化酶的转录表达主要受Nrf2/ARE信号通路的调控。在静息状态下，Nrf2在胞质中与Keap1结合形成复合体。当复合体遭到破坏，Nrf2会转位至细胞核内与ARE序列结合，促进抗氧化酶的表达［5］。

目前临床上针对AD的药物很少，而且这些药物都是对症治疗，并不能逆转或根治AD，因此寻找有效的AD防治药物显得非常迫切。天然药物尤其是中药，一直以来在疾病防治方面都有着明显的优势。从中药中发掘和开发具有神经细胞保护作用的化合物和防治AD的药物，已经成为国内外新药研发的热点。

三七是我国传统名贵中药，为五加科人参属植物三七的干燥根，其性甘、温，微苦，主入肝、胃经，具有化瘀止血，活血定痛的功能，临床上主要用于心脑血管疾病的治疗。三七总皂苷是三七的主要活性成分，文献报道三七中的一些单体成分如人参皂苷Rg1、Rb1等对AD具有防治作用［6］。但是，三七总皂苷防治AD的药效及其作用机制，目前尚不清楚。

因此，本研究通过建立AD体外模型Aβ25－35诱导PC12细胞凋亡，从氧化应激和凋亡角度考察三七总皂苷的神经保护作用，并考察三七总皂苷对Nrf2/HO-1信号通路的调控作用，探索三七总皂苷防治AD的分子机制。为进一步研究中药抗AD的分子机制提供实验依据。

1 材料与仪器

1.1 药物与试剂 三七总皂苷购自上海融禾医药科技发展有限公司；PC12细胞由中国医学科学院北京协和医学院细胞库提供；DMEM培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司；LDH、MDA、SOD、CAT和GSH-Px检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；ROS检测试剂盒和JC-1购自美国Enzolife sciences；Caspase-3荧光检测试剂盒购自美国BioVision；Nrf2 和HO-1抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology；In Situ Cell Death Detection Kit，POD试剂盒购自美国Roche。

1.2 主要仪器 二氧化碳培养箱购自美国Thermo Scientific；超净工作台购自上海智成分析仪器制造有限公司；倒置相差显微镜购自日本Olympus；离心机购自中国Anke；酶标仪购自美国Bio-Tek；荧光显微镜购自德国Leica；PYY-7C型电泳仪购自北京市六一仪器厂；Chemi DOCTM型凝胶成像系统购自美国Bio-Rad。

2 方法

2.1 细胞培养和药物配制 PC12细胞用含有10％胎牛血清，5％马血清，100 000 U·L－1青霉素和100 mg·L－1链霉素的DMEM完全培养基进行培养。三七总皂苷溶于DMSO配制成储备溶液（100 g ·L－1），然后稀释成所需浓度使用。空白对照组细胞DMEM中添加等量的DMSO，浓度不高于1‰。

2.2 MTT法检测细胞活力 PC12细胞经实验处理后，吸掉培养液，加入MTT溶液（终浓度为1 g· L－1），37°C继续孵育4 h。然后用DMSO溶解细胞产生的甲。将96孔板置振荡器中振摇10 min后，置酶标仪中，570 nm处测定每孔OD值。细胞活力用实验组OD值占正常对照组OD值的百分比表示。

2.3 乳酸脱氢酶（LDH）漏出率检测 收集细胞培养液，测定培养液中LDH活力，胰蛋白酶消化收集细胞，反复冻融破碎细胞，测定细胞中LDH活力，LDH漏出率＝培养液中LDH活力/（培养液中LDH活力＋细胞中LDH活力）。

2.4 TUNEL法检测细胞凋亡 PC12细胞（每孔1 ×105）种植于放在6孔板中的细胞爬片上，继续培养24 h。细胞经实验处理后，4％多聚甲醛室温固定30 min。PC12细胞滴加0.3％H2O2孵育30 min，并滴加0.1％Triton X-100溶液孵育30 min。滴加N末端脱氧核苷酸转移酶后，细胞爬片置于湿盒中37℃孵育1 h，然后滴加抗地高辛结合物孵育30 min。DAPI（100 g·L－1）染细胞核，荧光显微镜观察并拍照。

2.5 线粒体膜电位检测 线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。线粒体膜电位的变化用JC-1染料检测，常用红绿荧光相对比例来衡量。PC12细胞经实验处理后，加入JC-1溶液（终浓度为2μmol·L－1），37°C避光孵育30 min，PBS洗两遍，DAPI（100 g·L－1）染细胞核，荧光显微镜进行观察拍照。

2.6 Caspase-3活力检测 Caspase-3是细胞凋亡过程中关键的执行分子。Caspase-3能分解底物DEVD-AFC释放AFC，DEVD-AFC发蓝光，游离的AFC发出黄绿荧光，用酶标仪测定AFC的荧光值就可以检测Caspase-3活力。PC12细胞经实验处理后，胰蛋白酶消化收集细胞，用50 μL的冷细胞裂解液重悬细胞，冰上孵育10 min，经蛋白浓度测定后使用50 μg的细胞裂解物。每个样品加入50 μL的2×反应缓冲液（含10 mmol·L－1DTT），加入5 μL 的DEVD-7-amino-4-trifluorom-ethylcoumarin（终浓度为50 μmol·L－1），37℃孵育2 h。酶标仪读取样品荧光值，激发波长为400 nm，发射波长为505 nm。

2.7 细胞内总ROS检测 细胞内总ROS水平用总ROS检测试剂盒测定。PC12细胞经实验处理后，胰蛋白酶消化收集细胞，1×washing buffer洗1遍，加入carboxy-H2DCFDA（终浓度25μmol·L－1）溶液，37℃避光孵育30 min，用高内涵仪器检测荧光值。

2.8 氧化应激水平检测 收集PC12细胞培养上清液，使用南京建成试剂盒检测PC12细胞MDA含量。胰蛋白酶消化收集PC12细胞，反复冻融裂解细胞。4℃，3 000 r·min－1离心10 min取上清，使用南京建成试剂盒测定抗氧化酶SOD、CAT和GSH-Px活力。

2.9 Western blot检测蛋白表达 胰蛋白酶消化收集PC12细胞，加入含有蛋白酶抑制剂，磷酸酶抑制剂和PMSF的组织蛋白抽提试剂，冰上裂解30 min。放入预冷的离心机离心，12 000 r·min－1离心15 min。吸取上清液至预冷的EP管中，－80℃保存待用。BCA试剂盒定量样品蛋白浓度。将SDS-PAGE上样缓冲液与蛋白样品按1∶4混匀，煮沸5 min，使蛋白充分变性，－80℃保存待用。取等量蛋白样品经10％SDS-PAGE，80V电泳至溴酚蓝到达分离胶底部。将胶安装至转膜装置，100 V，300 mA转膜1 h。取NC膜置于5％脱脂牛奶（TBST配制）摇床封闭2 h。一抗4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，每次15 min，HRP标记的二抗孵育2 h。TBST洗膜3次，每次15 min，用增强型ECL显色液避光孵育5 min后，凝胶成像系统进行显影拍照。

3 结果

3.1 三七总皂苷能够抑制Aβ25－35诱导PC12细胞的细胞活力下降 Aβ25－35处理能够以浓度和时间依赖的方式降低PC12细胞的细胞活力（Fig 1A，P ＜0.01），最终选择20 μmol·L－1，作用24 h作为造模条件。不同浓度的三七总皂苷（6.25、12.5、25和50 mg·L－1）预孵育4、8、12和24 h能够以浓度和时间依赖的方式抑制Aβ25－35诱导PC12细胞的细胞活力下降（Fig 1B，P＜0.01），最终确定三七总皂苷给药浓度为25 mg·L－1，作用时间为24 h。而且，三七总皂苷预孵育能够抑制Aβ25－35诱导PC12细胞LDH漏出（Fig 1C，P＜0.01）。然而，三七总皂苷只加药对PC12细胞活力没有影响（Fig 1D，P＞0.05）。表明三七总皂苷预孵育能够明显抑制Aβ25－35诱导PC12细胞的细胞活力下降。

Fig 1 Effect of PNS on cell viability of PC12cells

3.2 三七总皂苷能够明显抑制Aβ25－35诱导PC12细胞的凋亡 与对照组比较，Aβ25－35处理明显增加TUNEL阳性细胞的数目（Fig 2A）和TUNEL阳性细胞率（Fig 2B，P＜0.01）。表明Aβ25－35处理能够导致PC12细胞DNA断裂。三七总皂苷预孵育能够明显抑制Aβ25－35导致的DNA断裂（Fig 2）。我们进一步考察了线粒体膜电位的变化，Aβ25－35能够明显降低线粒体膜电位（Fig 2C、D，P＜0.01）。与对照组相比，Aβ25－35组的荧光值降低至80％，而PNS＋Aβ25－35组的荧光值则为95％。表明Aβ25－35能够使PC12细胞线粒体膜电位去极化。同时，我们发现Aβ25－35能够增强caspase-3活性（Fig 2E，P＜0.01）。与对照组相比，Aβ25－35组的荧光值增加至156.29％，而PNS＋Aβ25－35组的荧光值则为122.88％，三七总皂苷预孵育能够明显抑制Aβ25－35诱导的线粒体膜电位的下降和caspase-3活性的增强（Fig 2C～E，P＜0.01），表明三七总皂苷能够明显抑制Aβ25－35诱导PC12细胞的凋亡。

3.3 三七总皂苷预孵育能够明显抑制Aβ25－35诱导PC12细胞氧化应激 与对照组比较，Aβ25－35处理导致PC12细胞内ROS浓度明显增加（Fig 3A、B，P ＜0.01）。与对照组ROS荧光值相比，Aβ25－35组的荧光值增加至165.23％，PNS＋Aβ25－35组则为119.15％，脂质过氧化产物MDA也明显增加（Fig 3C，P＜0.01）。而且，细胞内抗氧化酶SOD、CAT和 GSH-Px活力明显下降（Fig 4D-4F，P＜0.01）。然而，三七总皂苷预孵育能够明显抑制Aβ25－35诱导的这些氧化应激指标的变化。提示三七总皂苷预孵育能够明显抑制Aβ25－35诱导C12细胞氧化应激。

Fig 2 Effect of PNS on Aβ25－35induced apoptosis in PC12 cells

3.4 三七总皂苷预孵育能够上调PC12细胞Nrf2 和HO-1的表达 为探讨三七总皂苷的神经细胞保护作用机制，我们重点考察了三七总皂苷对PC12细胞Nrf2/HO-1信号通路的影响。Western blot实验结果表明，三七总皂苷预孵育能够明显增加PC12细胞核内Nrf2的蛋白表达水平（Fig 4A）。同时，三七总皂苷预孵育能够明显增加PC12细胞质中HO-1的蛋白表达水平（Fig 4A）。我们进一步采用HO-1活性抑制剂SnPP预孵育PC12细胞，观察SnPP对三七总皂苷介导的抗凋亡作用的影响，发现SnPP能够抑制三七总皂苷介导的抗Aβ25－35毒性作用（Fig 4B）。与对照组相比，PNS＋Control组的蛋白浓度为升高到198.24％，PNS＋Aβ25－35组的蛋白浓度升高至188.13％，而PNS＋Aβ25－35＋SnPP组的则为135.50％。提示HO-1在三七总皂苷介导的抗Aβ25－35毒性作用中发挥重要作用。

Fig 3 Effect of PNS on Aβ25－35induced oxidative stress in PC12 cells

4 讨论

尽管AD的发病机制目前尚未完全清楚，但是Aβ被广泛认为是AD神经退行性病变的主要原因。如果使用药物抑制Aβ的神经毒性，可能具有神经保护作用。此次实验我们采用了一种普遍接受的体外模型，使用Aβ25－35诱导PC12细胞凋亡来考察三七总皂苷防治AD的神经保护作用。我们发现三七总皂苷能够明显抑制Aβ25－35诱导PC12细胞活力的下降和LDH漏出，抑制Aβ25－35诱导PC12细胞DNA断裂，并明显抑制Aβ25－35诱导PC12细胞线粒体膜电位的下降和caspase-3活化，表明三七总皂苷能够明显抑制Aβ25－35诱导PC12细胞凋亡。

Fig 4 Effect of PNS on expression of Nrf2 and HO-1 in PC12 cells

研究表明，氧化应激介导了Aβ的神经毒性并参与了AD神经细胞退行性过程。氧化应激是指活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生与机体内抗氧化防御系统的清除之间失衡，其中大量ROS的产生超过了内源性抗氧化酶系统的抗氧化能力。氧化应激能够导致脂质过氧化，蛋白和DNA氧化和氧化还原状态的改变，促进神经细胞凋亡［7］。我们发现Aβ能够诱导PC12细胞内ROS积聚，MDA的产生，降低SOD、CAT和GSH-Px活力。三七总皂苷能够抑制Aβ25－35诱导PC12细胞氧化应激。

我们进一步考察了三七总皂苷抑制Aβ25－35诱导PC12细胞氧化应激的分子机制。机体在抗氧化应激过程中产生了很多防御性机制，其中Nrf2/ARE信号通路的活化是重要环节。我们发现三七总皂苷明显增加细胞核内Nrf2蛋白表达水平，并明显上调HO-1的蛋白表达。而且，HO-1活力抑制剂SnPP预孵育则能抑制三七总皂苷介导的神经细胞保护作用。这些结果表明，三七总皂苷可能是通过活化Nrf2/ARE/HO-1信号通路，发挥神经细胞保护作用。但是，Nrf2从Keap1-Nrf2复合体中释放的分子机制，需要后续实验进行确证。

综上所述，三七总皂苷能够抑制Aβ25－35诱导的神经细胞氧化应激和凋亡，其作用机制可能是活化Nrf2/ARE信号通路，上调抗氧化酶HO-1的表达，但仍需进行体内外实验进一步验证三七总皂苷抗AD的药效以及药效作用机制。

〔致谢：本研究所有实验均在中国医学科学院、北京协和医学院药用植物研究所中药（天然产物）创新药物研发北京市重点实验室进行。感谢汪梦霞同学及实验室同学对实验的帮助，以及孙桂波老师、孙晓波老师、赵自明老师和孟祥宝老师对本研究及文章的指导。〕

［1］ Pachalska M，Bidzan L，Bidzan M，et al.Vascular factors and cognitive dysfunction in alzheimer disease［J］.Med Sci Monit，2015，21：3483－9.

［2］ 张 颖，林森相，华 茜，等.三七和栀子有效成分对AD转基因小鼠早期脑内淀粉样蛋白清除作用的研究［J］.中国药理学通报，2012，28（2）：173－9.

［2］ Zhang Y，Lin S X，Hua X，et al.Research on the mechanism of the active ingredients of Sanchi and Gardenia removing the early amyloid in the AD transgenic mouse brain［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28（2）：173－9.

［3］ Serrano-Pozo A，Hyman B T.Alzheimer disease：Alzheimer de-mentia with sparse amyloid-AD mimic or variant［J］？.Nat Rev Neurol，2015.

［4］ Grimm A，Friedland K，Eckert A.Mitochondrial dysfunction：the missing link between aging and sporadic Alzheimer＇s disease［J］.Biogerontology，2015［Epub ahead of print］

［5］ Johnson D A，Johnson J A.Nrf2-a therapeutic target for the treat-ment of neurodegenerative diseases［J］.Free Radic Biol Med，2015，88（Pt B）：253－67.

［6］ Zhang G L，Deng J P，Wang B H，et al.Gypenosides improve cognitive impairment induced by chronic cerebral hypoperfusion in rats by suppressing oxidative stress and astrocytic activation［J］.Behav Pharmacol，2011，22（7）：633－44.

［7］ Mohsenzadegan M，Mirshafiey A.The immunopathogenic role of reactive oxygen species in Alzheimer disease［J］.Iran J Allergy Asthma Immunol，2012，11（3）：203－16.

Protective effect of Panax Notoginseng Saponins of Nrf2 signaling pathway on apoptosis of PC12 cells induced by Aβ25－35

ZHAO Jing-yu1，2，WANG Meng-xia1，2，ZHAO Zi-ming2，MENG Xiang-bao3，SUN Gui-bo3，SUN Xiao-bo3
（1.Guangdong Second Traditional Chinese Medicine Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China；2.Guangdong Province Municipal Institute of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510095，China；3.Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences＆Peking Union Medical College；Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine，Bejing 100193，China）

Aim To investigate the protective effect of Panax Notoginseng Saponins（PNS）on Aβ25－35-in-duced apoptosis in PC12 cells and molecular mecha-nism.Methods The cell viability of PC12 cells was detected by MTT assay.The levels of LDH leakage，ROS，MDA，Caspase-3 activity and antioxidant enzyme activities of SOD，CAT，and GSH-Px activity were de-termined by respective kits.The apoptosis of cells was decteced by Western blot.Results PNS could signifi-cantly inhibit the decrease of cell viability and LDH leakage，reduce the production of MDA and ROS（P＜ 0.01），increase the activity of SOD，CAT and GSH-Px （P＜0.01），and the mitochondrial membrane poten-tial，inhibit the activation of caspase-3（P＜0.01）in PC12 cells which were induced by Aβ25－35.PNS could incrase nuclear Nrf2 and up-regulate HO-1.The neu-roprotective of PNS could be inhibited by HO-1 inhibi-tor ZnPP.Conclusion PNS may inhibit Aβ25－35-in-duced oxidative stress and apoptosis in PC12 cells by activating Nrf2/HO-1 signaling pathway.

Alzheimer’s disease；panax notoginseng saponins；oxidative stress；apoptosis；Nrf2；HO-1

时间：2016－2－26 10：20 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160226.1020.020.html

10.3969/j.issn.1001－1978.2016.03.010

A

1001－1978（2016）03－0343－07

R284.1；R329.25；R349.1；R745.7；R977.6

2015－11－26，

2015－12－30

国家自然科学基金资助项目（No 81503290）；中医药行业科研专项（No 201507004）；国家重大创新药创制专项（No 2012ZX09501001-004）

赵静宇（1991－），女，硕士生，研究方向：中药药理学，E-mail：zhaojingyu1991＠126.com；孙桂波（1973－），女，博士，研究员，研究方向：中药药理学，E-mail：sunguibo＠126.com；孙晓波（1958－），男，博士，研究员，研究方向：中药药理学，Tel/Fax：010-57833013，E-mail：xbsun＠implad.ac.cn