钠钾ATP酶抑制剂通过调节DNA损伤感应复合体Mre11/Rad50/Nbs1的表达诱导肝癌HepG2细胞周期阻滞

徐忠伟，王凤梅，王聪聪，单娜娜，徐瑞成，3

（1.中国人民武装警察部队后勤学院，天津 300309；2.天津市第三中心医院，天津 300170；3.天津市职业与环境危害生物标志物重点实验室，天津 300309）

钠钾ATP酶抑制剂通过调节DNA损伤感应复合体Mre11/Rad50/Nbs1的表达诱导肝癌HepG2细胞周期阻滞

徐忠伟1，王凤梅2，王聪聪1，单娜娜1，徐瑞成1，3

（1.中国人民武装警察部队后勤学院，天津 300309；2.天津市第三中心医院，天津 300170；3.天津市职业与环境危害生物标志物重点实验室，天津 300309）

目的 研究钠钾ATP酶抑制剂华蟾毒配基（cinobufa-gin）对人肝癌HepG2细胞DNA损伤修复阻断及其发生机制。方法 免疫组化分析人肝癌临床组织标本、正常肝组织中钠钾ATP酶α1亚单位的表达；以人肝癌细胞HepG2为靶细胞，实验分为对照组、5 μmol·L－1华蟾毒配基作用6、12 和24 h组；单细胞电泳检测DNA双链断裂，Real time-PCR 和Western blot检测损伤修复基因Mre11、Rad50、Nbs1和p53的表达变化，流式细胞术检测细胞周期。结果 肝癌组织钠钾ATP酶α1亚单位表达与癌旁组织相比明显升高（P＜0.05）；华蟾毒配基诱导HepG2细胞DNA断裂的发生率与作用时间高度相关，作用时间延长断裂效应更加明显（P＜0.05），Mre11，Nbs1，Rad50和p53表达随药物作用时间延长逐渐升高（P＜0.05），流式细胞术分析细胞周期对照组S期细胞比例为（21.32±4.21）％，5 μmol·L－1华蟾毒配基处理6 h后为（33.25±5.72）％，处理12 h后为（56.72± 6.29）％，作用24 h后为（67.32±9.42）％。结论 华蟾毒配基激活Mre11/Rad50/Nbs1损伤感应复合体介导肝癌HepG2细胞周期阻滞。

华蟾毒配基；HepG2细胞；DNA双链断裂；钠钾ATP酶；细胞周期；细胞周期相关蛋白

原发性肝癌（简称肝癌）是临床中最常见的恶性肿瘤之一。蟾酥为宝贵的中药之一，已被作为药物使用近千年，《本草纲目》记载“蟾酥，疗疳积，消臌胀，解疔毒之药也”。而华蟾毒配基（cinobufagin）是中药蟾酥的主要抗癌活性成分之一，目前是我国临床治疗中晚期肝癌的首选中药制剂，药物作用靶点为细胞膜表面钠钾ATP酶（Na＋，K＋-ATPase）［1］。研究证实非小细胞肺癌、神经胶质瘤、肝细胞癌和乳腺癌等肿瘤细胞中钠钾ATP酶呈现高表达状态，参与调控肿瘤细胞的发生和发展［2－3］。前期的研究显示华蟾毒配基可下调肝癌细胞周期蛋白A（cyclin A）表达引发细胞周期S期阻滞现象［4－5］。然而蟾酥制剂在治疗肝癌中的作用机制仍然不明确。因此，研究华蟾毒配基抑制肝癌细胞生长，探讨其作用机制，意义重大。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 人肝癌细胞株HepG2购自协和基础医学院细胞库，华蟾毒配基为Sigma公司产品，无水乙醇溶解成母液，浓度为1 mmol·L－1，－20℃避光保存；H-DMEM培养基，胎牛血清购自Gibco公司。TRIzol为Invitrogen公司产品；四甲基偶氮唑盐（MTT）、碘化丙啶（PI）和二甲基亚砜（DMSO）购自于Sigma公司；PrimeScriptTMRT逆转录试剂购自于TaKaRa公司；SYBR GreenⅠ染料为Roche公司产品，一抗兔抗人Mre11、Nbs1、Rad50和p53单克隆抗体购自Abcam公司，二抗和ECL化学发光试剂购自KPL公司。

1.2 免疫组化检测肝癌组织与肝癌旁组织中钠钾ATP酶α1亚单位表达 90例肝癌与癌旁组织样本，年龄（49.8±8.8），均为原发性肝癌肿瘤。常规处理，石蜡包埋切片，高压蒸汽抗原修复，3％H2O2室温孵育30 min；兔血清封闭10 min，Na＋，K＋-AT-Pase α1羊单克隆抗体，4℃孵育过夜，二抗室温孵育30 min，3，3-二氨基联苯胺（DAB）显色5 min，冲洗，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，每张切片随机选取3个视野LeicaBM2500拍照，图像数据由Im-age-Pro Plus 6.0软件分析，测量阳性结果区域面积和积分光密度值，计算样本的平均光密度值，分析肝癌与癌旁组织中Na＋，K＋-ATPase α1亚单位表达水平。

1.3 单细胞电泳检测DNA双链断裂程度 实验分组同前，第1层胶制作：取0.5％常温熔点琼脂糖溶液熔化后包被载玻片，冷却充分凝固。第2层胶制作：100 μL 0.5％低熔点琼脂糖溶液中混合500个细胞，均匀滴在第1层胶上，充分冷却。玻片浸入预冷裂解液［10 mmol·L－1Tris-HCl（pH 7.5）2.5 mol·L－1NaC1，100 mmol·L－1四甲基乙二胺四乙酸二钠，1％Triton X-100和10％二甲基亚砜］，4℃，2 h。置于水平电泳槽中，加入电泳液（1 mmol· L－1四甲基乙二胺，300 mmol·L－1氢氧化钠），静置20 min，25 V电泳30 min。25 g·L－1碘化丙啶（PI）75 μL染色，荧光显微镜下观察结果。采用CASP1.2软件分别计算彗星头部和尾部积分面积（Head Area和Tail Area）与荧光强度（Head DNA and Tail DNA Amount），计算各自荧光密度值，同时检测彗星尾部迁移长度（Tail Moment）。通过分析彗星头部光密度值和彗星尾部长度与荧光密度值评估DNA损伤。

1.4 RNA提取和Real time-PCR检测Mre11、Nbs1、Rad50和p53 mRNA表达 实验分组同前，TRIzol法提取细胞总RNA，按PrimeScriptTMRT试剂反转录合成cDNA。反应体系为20 μL（上、下游引物各1 μL，模板1 μL，SYBR green试剂4 μL，ddH2O 12 μL）。引物序列见Tab 1，反应条件：95℃变性10 min：95℃变性5 s，65℃退火15 s，72℃延伸15 s，共40个循环。通过相对定量法（2－△△Ct）分析实验组目的基因表达丰度。

Tab 1 Sequences of PCR primers

1.5 Western blot法检测Mre11、Nbs1、Rad50和p53蛋白表达 实验分组同前，蛋白印迹实验参考以前方法［6］，每组60 μg蛋白通过10％SDS-PAGE分离，Bio-rad半干转印系统转膜，经抗体孵育，经ECL液化学发光，暗室X线曝光、显影、定影。Bandscan 5.0软件进行灰度值分析。

1.6 流式细胞术检测细胞周期 接种1×105个HepG2细胞，培养24 h后加药，实验分组同前，药物作用6、12和24 h后，收集细胞，75％冷乙醇固定，PBS洗1次，加入终浓度为50 mg·L－1RNA酶和5 g·L－1碘化乙啶（PI）溶液，孵育20 min，流式细胞仪检测细胞周期变化。

2 结果

2.1 人肝癌组织与正常肝组织钠钾ATP酶α1亚单位的差异化表达 通过IPP6.0软件分析肝癌与癌旁组织中钠钾ATP酶α1亚单位表达的平均光密度。Fig 1显示，肝癌组织钠钾ATP酶α1亚单位密度值为184.74±17.22，癌旁组织为67.21± 8.41，肝癌组织中钠钾ATP酶α1亚单位与正常肝脏癌旁组织相比呈现高表达状态，差异有统计学意义（P＜0.05）。

Fig 1 Expression level of Na＋，K＋-ATPase α1 subunit in normal liver tissues and hepatoma tissue by｜Immunohistochemistry（×400）

2.2 华蟾毒配基诱发HepG2细胞DNA双链断裂5 μmol·L－1华蟾毒配基可引起HepG2细胞DNA损伤（Fig 2）。药物组细胞电泳后可见彗星状拖尾，对照组呈现明亮的圆点无拖尾，经CASP 1.2软件分析测量对照组彗星头部荧光强度为84.21± 9.76，尾部荧光强度4.87±0.58，彗星无拖尾迁移现象发生；药物作用6、12和24h后，头部荧光强度

分别为43.2±5.32、38.46±5.74、18.52±3.21，尾部荧光强度分别为23.2±3.12、31.46±4.64、38.52 ±6.21；彗星尾部长度依次为（26.21±2.47）、（28.42±3.14）、（31.22±5.31）μm，差异具有统计学意义（P＜0.05）。研究证实，5 μmol·L－1华蟾毒配基可诱发HepG2细胞DNA双链断裂。

2.3 华蟾毒配基对HepG2细胞DNA损伤感应基因Mre11、Nbs1、Rad50和p53 mRNA表达的影响通过相对定量法（2－△△Ct）计算各实验组HepG2细胞的相关基因表达（Tab 2），5 μmol·L－1华蟾毒配基作用HepG2细胞6、12和24 h 3个检测点中，Mre11基因水平分别是对照组的1.29、2.53和7.67倍；Nbs1基因水平分别是对照组的1.16、1.34和1.72倍；Rad50基因水平分别是对照组的1.49、2.97和3.71倍；p53基因水平分别是对照组1.37、3.58和5.94倍。结果显示，5 μmol·L－1华蟾毒配基可明显上调DNA损伤感应相关基因Mre11、Rad50、Nbs1和p53 mRNA表达（P＜0.05）。

Fig 2 Levels of DNA double-strand breaks in HepG2 cells treated with 5 μmol·L－1 cinobufagin for different time by SCGE（×400）

Tab 2 Mre11，Nbs1，Rad50 and p53 detected in HepG2 treated with 5 μmol·L－1cinobufogenin by Real time PCR±s）

Tab 2 Mre11，Nbs1，Rad50 and p53 detected in HepG2 treated with 5 μmol·L－1cinobufogenin by Real time PCR±s）

*P＜0.05；**P＜0.01 vs control group

Relative amount（2－△△Ct）Gene Expose time/h 6 12 24 Mre11 0.37±0.21* 1.34±0.37* 2.94±0.34**Nbs1 0.22±0.12 0.42±0.14** 0.78±0.27**Rad50 0.58±0.23 1.57±0.31** 1.89±0.42**p53 0.45±0.32* 1.84±0.37** 2.57±0.49**

2.4 华蟾毒配基对HepG2细胞DNA损伤感应基因Mre11、Nbs1、Rad50和p53蛋白表达的影响Western blot结果显示（Fig 3），与对照组细胞相比，5 μmol·L－1华蟾毒配基作用HepG2细胞后，可上调DNA损伤感应基因Mre11、Nbs1、Rad50和p53蛋白表达，差异有统计学意义（P＜0.05），以作用24 h处理组差异更为明显（P＜0.01）。

2.5 流式细胞仪检测HepG2细胞周期变化 Fig 4所示，流式细胞术分析细胞周期对照组S期细胞比例为（21.32±4.21）％，5 μmol·L－1华蟾毒配基处理6 h后为（33.25±5.72）％，处理12 h后为（56.72±6.29）％，作用24 h后为（67.32± 9.42）％，结果显示5 μmol·L－1华蟾毒配基引起HepG2细胞发生S期阻滞现象，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

Fig 3 Mre11，Nbs1，Rad50 and p53 protein levels in HepG2 treated with 5 μmol·L－1cinobufagin for different time by Western blot

Fig 4 Effect of cell cycle on HepG2 cells treated with 5 μmol·L－1cinobufogenin for different time by flow cytometry

3 讨论

蟾酥及相关制剂作为抗肿瘤中药在我国广泛用于肝癌、结肠癌、乳腺癌和胃癌等恶性肿瘤的中晚期治疗，疗效显著，蟾酥的主要抗癌有效成分为蟾毒配基类，如华蟾毒配基（cinobufagin）和蟾蜍灵（bufa-lin）等，属于强心甾类固醇（cardiotonic steroids，CTS）。以华蟾素（混合制剂）为代表的药物在市场中占有重要份额，国际上关于CTS抗癌作用研究取得重要进展，比利时从非洲植物大牛角瓜中提取的CTS经半合成得到的新型钠钾ATP酶抑制剂UN-BS1450，作为高活性抗癌药进入欧洲临床，显示了巨大潜力［7－9］。

研究显示［1－3］，钠钾ATP酶α1亚单位在正常组织和肿瘤组织呈现出差异化表达，在人前列腺癌PC-3、DU-145细胞系，非小细胞肺癌A549细胞系，神经胶质瘤Hs683、U373-MG、U87-MG和T98G细胞系中钠钾ATP酶α1亚单位都呈现出高表达状态，课题组研究发现在肝癌组织中钠钾ATP酶α1亚单位亦呈现高表达状态，我们前期应用哇巴因与华蟾毒配基作用肝癌细胞后，细胞内游离Ca2＋和氧自由基（reactive oxygen species，ROS）浓度增加，损伤细胞DNA，以Cyclin D1为代表的细胞周期调控蛋白生成减少和细胞周期抑制因子p21CIP1引起细胞周期S期阻滞。华蟾毒配基可抑制钠钾ATP酶活性，继发性引起细胞内K＋浓度减少，同时伴随Na＋浓度增加，从而使细胞膜Na＋-Ca2＋交换器启动，诱发细胞内Ca2＋持续性升高，破坏线粒体膜电位，氧自由基浓度升高。这些细胞内离子物质是损伤细胞DNA的主要物质［10－12］。

由细胞DNA损伤转变成细胞周期阻滞信号并引起周期阻滞过程，主要有DNA损伤的识别（感受损伤）和效应蛋白分子变化（效应器蛋白）两个部分构成［13－14］。本研究发现华蟾毒配基可引起肝癌细胞DNA分子双链断裂，损伤感受蛋白Mre11，Nbs1 和Rad50基因和细胞周期负调控因子p53表达上调。而Mre11/Rad50/Nbs1（MRN）复合体能将检测到的DNA损伤的情况传递给效应器蛋白分子ATM激酶，其对DNA双链断裂产生应答反应，可将信息传导到p53蛋白，p53激活，半衰期延长，促进p21CIP1表达，p21CIP1与CyclinA/CDK2/PCNA激酶复合体结合，抑制其活性，产生细胞出现S期阻滞现象，争取更多的修复时间，在修复无法完成时细胞走向最终的凋亡途径。

综上所述，以华蟾毒配基为代表的钠钾ATP酶抑制因子可能将成为一类新的抗肝癌候选药物，通过破坏癌细胞离子平衡、能量供应，损伤癌细胞DNA分子，引起细胞周期阻滞，诱导细胞凋亡。

（致谢：本文实验在武警后勤学院中心实验室完成，徐瑞成主任为研究项目国家自然科学基金项目负责人，徐忠伟老师为主要实验操作人员，王凤梅主任负责肝癌与癌旁组织样本实验检测，王聪聪老师完成实验数据统计分析与论文审校工作。）

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Na＋，K＋-ATPase inhibitor induces cell cycle arrest in liver cancer HepG2 cells by regulating expression of DNA damage Mre11/Rad50/Nbs1 complex

XU Zhong-wei1，WANG Feng-mei2，WANG Cong-cong1，SHAN Na-na1，XU Rui-cheng1，3
（1.Logistics University of People’s Armed Police Force，Tianjin 300309，China；2.Dept of Gastroenterology and Hepatology，Tianjin Third Central Hospitaln，Tianjin 300170，China；3.Tianjin Key Laboratory for Biomarkers of Occupational and Environmental Hazard，Tianjin 300309，China）

Aim To explore the relationship between Mre11/Rad50/Nbs1（MRN）complex focus formation and DNA double-strand breaks（DSBs）caused by cinob-ufagin in human hepatocellular carcinoma HepG2 cells.Methods The Na＋，K＋-ATPase α1 subunit expression level in liver cancer tissues was detected by immunohis-tochemistry.After HepG2 cells were treated with 5 μmol·L－1cinobufagin for 6，12 and 24 h，the drug-in-duced DSBs were assessed by single cell gel electro-phroesis（SCGE），the gene transcription and protein levels of Mrel1，Nbs1，Rad50 and p53 were evaluated by Real time-PCR and Western blot.The cell cycle in parallel was analyzed by flow cytometry.Results The Na＋，K＋-ATPase α1 subunit expression level in liver cancer tissues was significantly increased compared with the tissue adjacent to carcinoma（P＜0.05）.The 5 μmol·L－1cinobufagin could induce the DSBs in a time-dependent manner（P＜0.05），and it could up-regulate the gene expression levels of Mre11，Nbs1，Rad50 and p53 in HepG2 cells（P＜0.05）.The pro-portions of HepG2 cells in S phase were（21.32± 4.21）％in the control group，and（33.25±5.72）％，（56.72±6.29）％and（67.32±9.42）％in HepG2 cells treated with 5 μmol·L－1cinobufagin for 6，12 and 24 h，respectively.The proportions of cells in S phase in cinobufagin groups were significantly increased compared with the control group（P＜0.05）.Conclu-sion Cinobufagin could induce the cell cycle arrest in liver cancer HepG2 cells by activation of Mre11/Rad50/Nbs1 Complex.

cinobufagin；HepG2 cells；DNA double-strand breaks；Na＋，K＋-ATPase；cell cycle；cell cycle associated proteins

时间：2016－2－26 10：20 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160226.1020.012.html

10.3969/j.issn.1001－1978.2016.03.006

A

1001－1978（2016）03－0323－05

R284.1；R282.74；R329.28；R342.3；R735.7；R977.3；R979.1

2015－11－09，

2015－12－24

国家自然科学基金资助项目（No 81273552）；武警后勤学院博士启动金项目（No WHB201501）

徐忠伟（1980－），男，博士，讲师，研究方向：中药药理学，Tel：022－84876424，E-mail：xzw113＠hotmail.com；徐瑞成（1968－），男，硕士，教授，研究方向：细胞信号转导，通讯作者，Tel：022-84876451，E-mail：xu＿rc＠sohu.com