超声波辅助氯化汞消毒污染组培枣苗的研究

陈宗礼， 张枝婵， 韩爱琴， 柏 勇， 杨 洋， 张乐元

(延安大学 生命科学学院 陕西省红枣重点实验室， 延安 716000)



超声波辅助氯化汞消毒污染组培枣苗的研究

陈宗礼， 张枝婵， 韩爱琴， 柏 勇， 杨 洋， 张乐元

(延安大学 生命科学学院 陕西省红枣重点实验室， 延安 716000)

摘要以细菌污染的晋南1号单倍体组培枣苗为材料，以乙醇、氯化汞和超声波为主要试验因素，采用随机区组试验设计，探讨超声波辅助氯化汞消毒拯救污染组培苗及外植体消毒的优化方法。结果表明，拯救污染组培苗的优化组合消毒方法是70%乙醇浸泡30 s+0.1%氯化汞浸泡4 min+超声(28 Hz, 25℃)15 min。该方法较之常规乙醇-氯化汞化学消毒方法，接种的外植体污染率降低了68.41%，其成活率提高了75.72%，增殖程度提高了4.41倍。该超声波辅助氯化汞消毒的理化新方法，降低了外植体消毒中氯化汞的使用浓度和消毒时间，减少了消毒对环境的污染，能极大地提高消毒效果，可扩展推广到所有植物组织培养中外植体的消毒。

关键词超声波；氯化汞；组培枣苗；污染；消毒

Study on the ultrasonic assisted disinfection method to save pollution tissue culture seedling

CHEN Zong-li, ZHANG Zhi-chan, HAN Ai-qin, BAI Yong, YANG Yang, ZHANG Le-yuan

(Shaanxi Key Laboratory of Chinese Jujube, College of Life Science, Yanan University, Yanan 716000, China)

AbstractTo obtainZizyphusjujubemill, Jinnan 1, tissue culture seedling contaminated with bacteria, methods were studied by using the ethanol, mercuric chloride and ultrasonic as primarily test factors together with the random block design of experiment. The results showed that optimal combined disinfection method for saving pollution tissue culture seedling was as follows samples soaked in 70% ethanol for 30 s, then in 0.1% mercuric chloride for 4 min and treated with ultrasonic(28 Hz, 25℃) for 15 min. Compared with the conventional ethanol-mercury chloride chemical disinfection method, pollution rate of inoculation explants with this method was reduced by 68.41%, the survival rate increased by 75.72%, the proliferation degree increased by 4.41 times. This new method of physical and chemical disinfection showed good feasibility.

Keywordsultrasonic; mercuric chloride; tissue culture jujube seedling; pollution; disinfection

植物组织培养中，筛选应用适宜的消毒方法，降低消毒剂对外植体的损伤及对环境的污染，抢救被污染的珍稀组培材料，提高无菌系的成活率一直是受到关注和值得研究的一个重要问题，也是一项关系到组培效率的关键技术。目前，大多数研究集中在关于应用化学消毒剂如乙醇、氯化汞、次氯酸盐等的不同组合消毒方法的研究[1-6]；也有少数关于辅助应用抗生素控制污染的研究[7]。众所周知，化学消毒剂的使用只有达到一定浓度和作用时间时才可杀灭细菌消除或降低污染，但这同时也会对外植体细胞造成一定损伤，从而影响外植体的存活和萌发概率；辅助应用抗生素虽可除去内部组织所带菌类，但其抑菌单一、药效时间短、稳定性差、容易使菌类产生抗药性等缺点而受到限制[7]；同时，较大浓度的化学消毒剂的残留物也会对环境造成一定的影响。因此，非化学杀菌剂得到了越来越多的重视，其中之一就是超声杀菌。近来，有关学者在不同植物组培[8-15]、微生物[16-18]和食品加工领域[19-21]进行了超声波辅助杀菌的消毒方法研究。植物组织培养中，新建的无菌系苗尤其是一些珍稀组培苗在实验室常被二次污染，致使试验受到严重影响甚或终止。关于拯救污染组培苗的方法的研究还未见报道。本文以晋南1号枣花药培养获得的单倍体试管二次污染苗为材料，进行了超声波辅助消毒的研究，旨在拯救二次污染的珍稀组培苗，同时探讨组培外植体消毒的优化方法。

1材料与方法

1.1材料

接种材料为继代培养到第4代二次污染的晋南1号枣(Zizyphejujubemill jinnan 1zao)单倍体试管苗，培养基为CyI[22]。由陕西省红枣重点实验室提供。晋南1号枣是陕西省红枣重点实验室于1999年由杨陵农博会引进的优良鲜熟枣品种(现种植于延安大学生物园内)，齐向英等2010年开展了晋南1号枣花药培养并于2012年获得单倍体株系试管苗，现存于陕西省红枣重点实验室。

主要试剂：无水乙醇(广东广华科技股份有限公司)，氯化汞(天津环通精细化工厂)，均为分析纯，使用时用重蒸水配制成所需浓度。

主要仪器：立式压力蒸汽灭菌锅(LDZX-75KBS, 上海申安医疗器械厂)，净化工作台(SW-CJ-1F, 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)，超声波清洗机(SB-5200DT, 宁波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2方法

1.2.1试验设计

在参阅文献和预试验的基础上，筛选乙醇、氯化汞、附加超声波处理3个主要影响消毒效果的因素，以不同浓度与时间组合形成11种消毒处理(A、B 、... K)，以文献上较多使用的消毒处理为对照(CK)，共计12种处理组合(表1)，每个处理重复3次，按随机区组设计安排试验。各处理均以CyI[22]为培养基。

表1 污染组培枣苗的组合消毒处理

1.2.2接种与培养

选择生理状况基本一致并被细菌污染的晋南1号枣单倍体试管苗，在无菌条件下，于净化工作台中剪取培养瓶中培养基以上污染组培苗的茎段，放入装有少量无菌水的无菌瓶中，先于无菌水清洗3次后按设计的污染苗不同消毒处理分别进行消毒处理。将消毒过的材料在无菌条件下用无菌水冲洗4次，修剪成约1cm长茎段接入培养瓶中[15]，每瓶接3个茎段，每个处理至少接入30个茎段，放入培养室进行培养。前3 d进行室内自然光培养，之后进行光照培养，培养室温度(25～28)℃, 相对湿度为50%～70%，光强为(1500～2000)lx，光照时数为12 h/d。

1.2.3观察与统计

试管苗培养中，定期进行观察统计。接种7 d后，观察统计各处理组培苗的成活数，污染数，褐化数；30 d时测量各处理的分枝数和苗高。最后计算污染率(污染数/接种总数×100%)，死亡率(死亡数/接种总数×100%)，褐化率(褐化数/接种总数×100%)，增殖程度(苗高系数×增值系数)；其中，苗高系数=平均苗高/接种苗高，增殖系数=分枝数/成活苗数。所有测量数据均用Microsoft Excel进行统计分析；以污染率、成活率、褐化率、增殖程度作为评价各污染苗消毒处理的效果。

2结果与分析

2.1不同消毒处理对晋南1号枣单倍体污染率的影响

试验结果见表2。表2结果经F检验，F处理=36.46>F0.01(20, 10)=4.41，处理间差异极显著。进一步进行SSR检验， 以CK的污染率最高[(18.33±2.36)%]，极显著地高于其它11种处理；E、I、G、J、K和F 污染率显著地高于H，极显著地高于C、A、B、D；H极显著地高于C；C极显著地高于A、B、D；而E、I、G、J、K和F相互间无显著差异；A、B、D相互间亦无显著差异；以A、B、D的污染率最低(均为0)。分析表明，以A、B、D 3种处理的消毒效果最优(可达0污染)，其次是C处理(比CK降低污染17.17%)，再次是H处理(比CK降低污染15.26%)，第4是E、I、G、J、K和F (比CK降低污染11.44%～14.32%)。说明氯化汞浓度为0.5%、作用时间为8 min时杀菌效果最好。

表2 不同消毒处理对单倍体试管枣苗污染率(%)的影响

小写字母表示0.05水平上差异显著；大写字母表示在0.01水平上差异显著。相同字母表示差异不显著；不同字母表示差异显著或差异极显著(下同)。

2.2不同消毒处理对晋南1号枣单倍体成活率的影响

试验结果见表3。表3结果经F检验，F处理=46.71>F0.01(20, 10)=4.41，处理间差异极显著。进一步进行SSR检验，以K处理的成活率最高，达(89.66%±3.67)%，极显著地高于E、D、A、F、H、CK、B和C，显著地高于G；K、I和J处理相互间无显著差异。G处理显著地高于E、D、A、F、H、CK、B和C，而E、D、A、F、H、CK、B和C 相互间亦无显著差异。分析表明，以K、I两种处理的成活率最优，达(86.14±4.58)%～(89.66±3.67)%，分别是CK的1.83和1.76倍，其次是J和G处理，成活率分别是CK的1.57倍和1.53倍，再次是A、B、C、D、E、F和H，它们的成活率与CK无显著差异。说明在超声波辅助下，氯化汞浓度为0.1%，作用时间4～6 min的消毒组合，其消毒材料的成活率相对最高，而氯化汞浓度相对高的或作用时间相对长的消毒组合，其消毒材料的成活率都在极显著地降低。

表3 不同消毒处理对单倍体试管枣苗成活率的影响

表4 不同消毒处理对单倍体试管枣苗褐化率(%)的影响

2.3不同消毒处理对晋南1号枣单倍体褐化率的影响

试验结果见表4。表4结果经F检验，F处理=54.60>F0.01(20, 10)=4.41，处理间差异极显著。进一步进行SSR检验，C处理的褐化率极显著地高于其它11个处理；B、H、A、D和F的褐化率极显著高于CK、G、E、J、I和K；CK显著高于G，极显著高于E、J、I和K；G和E显著地高于J和I，极显著高于K；而B、H、A、D和F处理相互间无显著差异；G、E和J处理相互间也无显著差异；I和K相互间亦无显著差异。分析结果表明，以K和I两种消毒处理的褐化率最低为(6.28±3.47)%～(8.07±3.88)%，比CK分别降低了80.77% 和75.28%；其次是G、E和J，比CK分别降低了41.41%、48.61%和69.04%；再次是B、H、A、D和F，比CK分别降低了70.71%、46.74%、37.67%、31.30%和30.90%。说明氯化汞浓度相对高的或作用时间相对长的消毒组合，其消毒材料的褐化率提高均极显著；而在相同氯化汞浓度下，辅助超声波消毒处理的褐化率提高极显著(如处理C> B，F> CK)；比较A、B 2种处理，在相同氯化汞浓度下，增加70%乙醇进行30 s的消毒处理(B)其褐化率比A有增加趋势，但增加不显著。

表5 不同消毒处理对单倍体试管枣苗增殖程度的影响

表6 各组合消毒处理结果的相关分析*

*：计算相关系数时不考虑A、B、C、D 4种处理，因其增殖程度均为零。

2.4不同消毒处理对晋南1号枣单倍体增殖程度的影响

试验结果见表5。表5结果经F检验，F处理=56.50>F0.01(20, 10)=4.41，处理间差异极显著。进一步进行SSR检验， I处理的增殖程度极显著地高于其它11种处理；J、E、K的增殖程度极显著地高于H、G、F，CK、A、B、C、D；H、G、F显著地高于CK，极显著地高于A、B、C、D；而J、E和K相互间无显著差异；H、G和F相互间也无显著差异；A、B、C、D和CK相互间亦无显著差异。分析表明，以I处理的增殖程度最高(9.98±0.96)，是CK的10.40倍；其次是J、E和K处理，增殖程度分别是CK的4.41、3.91和3.90倍；再次是H、G和F，增殖程度分别是CK的2.39、2.22和1.71倍；而A、B、C、D 4种处理的增殖程度比CK有所减少，但减少均不显著。说明相对较低浓度的氯化汞(0.1%)和较短的作用时间(4～5 min)辅助超声波(28 Hz，25℃，15 min)和70%乙醇30 s处理的消毒组合其增殖程度相对最好(如处理I、J)。

2.5优化消毒方案的选择

对试验结果的污染率、成活率、褐化率和增殖程度4项参数作两两相关分析(表6)显示：污染率与褐化率成弱正相关(Rc-b=0.09), 成活率与增殖程度成较强正相关(Rs-p=0.65), 污染率与成活率、污染率与增殖程度分别成弱负相关(Rc-s=-0.37,Rc-p=-0.27), 成活率与褐化率成强负相关(Rs-b=-0.96)，褐化率与增殖程度呈较强负相关(Rb-p=-0.62)。以上总体分析反映出，接种的外植体污染率高在一定程度上会促使其褐化，其成活率与增殖程度则相应降低(如处理CK)；接种的成活率高，其增殖程度将极显著地提高(如处理I、J、K)；接种的褐化率高或低则其成活率与增殖程度将极显著地降低或提高(如处理C、B、I、J、K、E)。

故评价不同消毒处理对外植体的消毒效果，既要考虑降低其污染率，即提高对有害微生物的灭菌效果，又要尽量减少消毒剂对外植体细胞的伤害，即要降低外植体的褐化率，提高外植体的接种成活率和增殖程度。据此，结合2.1至2.4的分析，A、B和D处理虽达零污染，但褐化率达(42.87±3.64)%～(55.74±2.89)%，成活率分别只有(55.05±5.93)%、(44.26±2.89)%和(11.28±7.47)%，增殖程度均为零；说明这几种处理对外植体的伤害均很大，主要是较高浓度的氯化汞和较长的消毒时间对外植体造成了毒害。而I处理的污染率[(5.8±2.37)%]极显著地低于CK(比CK降低了68.41%)；其褐化率[(8.07±3.88)%]虽与K相当，但却极显著地低于其它10种处理；其成活率[(86.14±4.58)%]虽与K相当，但却极显著地高于其它10种处理；其增殖程度(9.98±0.96)均极显著地高于其它11种处理。综合分析显示，以I组合消毒处理的消毒效果最优。

3讨论与结论

消毒技术是组培过程中的关键技术，关系到整个实验是否能够成功。本研究通过随机区组试验，筛选出拯救污染组培枣苗的优化消毒方法，即将外植体用70%乙醇浸泡30 s+0.1%氯化汞浸泡4 min+超声波28 Hz，25℃，15 min。用该方法，可比常用的消毒方法降低外植体污染率68.41%，提高其成活率75.72%。该方法可扩展到所有植物组织培养中外植体的消毒以及组培中被二次污染的珍稀组培材料的消毒拯救。

消毒技术中乙醇的常用浓度为70%，主要进行表面消毒，它能吸收细菌蛋白的水分使其脱水变性凝固，从而杀灭细菌，同时具有湿润作用，能排除外植体表层组织的空气，有利于其他灭菌剂的渗入；但其穿透力强，灭菌时间应控制在30 s以内[16]，延长时间会造成外植体脱水，促进褐化，影响其成活率和将来的生长状况。

氯化汞常用浓度为0.1%和0.5%，其杀菌原理是Hg2+可与带负电荷的蛋白质结合，使细菌蛋白变性、酶失活[14]，从而杀灭细菌；但其残毒较大，应用无菌水充分冲洗消毒过的外植体以最大限度地清除其残毒，否则会使外植体受到毒害而褐化。

采用超声波消毒的机理是空化效应，空化的基本效应有高温效应、放电效应、发光效应、压力效应等。其中起杀菌作用的主要是高温效应和压力效应，在空化所产生的高温高压条件下, 水能够分解成具有强氧化杀菌作用的OH-，H2O2而杀菌[8]；另外，“空化效应”会释放巨大能量, 产生局部瞬间高压, 形成冲击波, 使物体表面及液体介质受到极大的冲击力, 能量足以使细胞破裂，从而能使其中的菌体细胞壁、细胞质膜破裂，细胞内含物胶体发生絮凝沉淀，凝胶发生液化或乳化而失去生物活性，达到杀菌的目的[8, 17-19]。

超声与氯化汞联合处理与传统消毒方式相比可以降低氯化汞的用量及消毒时间，极大地降低了组培外植体的褐化率而提高了其成活率。

试验发现，在相同氯化汞浓度下，辅助超声波消毒处理的褐化率有极显著提高(如处理C> B，F> CK)，可能有以下原因：一方面，在液体中附着在外植体壁上的Hg2+在超声场的作用下会发生变化使之分散、松散、松脱而不易附着于外植体壁上[22]；但同时Hg2+会在超声波作用下获得巨大加速度，因此产生剧烈运动，在超声波的空化效应及伴随效应引起的促进溶液渗透作用[23]下又易于侵入外植体细胞内造成一定毒害；另一方面，在液体介质中超声作用下获得巨大加速度的分子因此产生的剧烈运动，还会引起组织细胞容积和内溶物移动、变化及细胞原浆环流，这种作用可引起细胞某些功能的改变而易引起一定程度伤害[24]；或许是这两方面的共同作用导致了超声波辅助消毒中枣外植体褐化率一定程度的提高。因此，在消毒过程中，研究设置合适的超声波处理功率和时间对于提高总体消毒效果也是非常必要的。

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中图分类号Q943.1,Q322;S665.1

文献标识码A

文章编号2095-1736(2016)02-0059-05

作者简介:陈宗礼，教授，研究方向为植物生物技术，E-mal: yadxczl@126.com。

基金项目：陕西省科技统筹创新工程计划项目(2013KTZB02-03-01)；陕西省高水平大学建设专项资金项目(2012SXTS06)；延安市科技计划项目(2009KN-25)

收稿日期：2015-07-20；修回日期：2015-08-31

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.02.059