瓜蒌皮总皂苷提取工艺优化及抑制金黄色葡萄球菌活性的研究

李婉珍，朱龙宝，陶玉贵，钱森和（安徽工程大学微生物发酵安徽省工程技术研究中心，安徽芜湖 241000）



瓜蒌皮总皂苷提取工艺优化及抑制金黄色葡萄球菌活性的研究

李婉珍，朱龙宝，陶玉贵，钱森和
（安徽工程大学微生物发酵安徽省工程技术研究中心，安徽芜湖 241000）

摘要：为确定瓜蒌皮总皂苷提取的最佳工艺，在对甲醇浓度、固液比、提取时间、提取温度、超声波功率进行单因素试验的基础上，设计4因素3水平的L9（34）正交试验优化超声辅助甲醇提取瓜蒌皮总皂苷的提取条件．结果表明：优化的瓜蒌皮总皂苷的提取条件为甲醇浓度50%、料液比1∶15、超声时间50min、超声功率150W，提取工艺因子的顺序为甲醇浓度＞超声时间＞料液比＝超声功率，瓜蒌皮总皂苷提取率由0．739%提高到0．986%．在此基础上进行皂苷提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌试验，结果表明，瓜蒌皮总皂苷对金黄色葡萄球菌有抑菌效果，抑菌圈为15．3mm．

关 键 词：瓜蒌皮；总皂苷；超声波辅助法；抑菌活性

瓜蒌为葫芦植物栝楼（Trichosanthes kirilowii Maxmi）的干燥成熟果实，是常用的中药之一．因其含有较为丰富的黄酮、皂苷、生物碱、甾醇、有机酸、三萜及其苷、蛋白、糖类和色素等物质，药理作用广泛．具有清热润肺、宽胸散结、缓解胸痹心痛及大便秘结等功效．药理研究表明，瓜蒌在抗肿瘤、抗溃疡、抗菌消炎、促进免疫、抗氧化、泻下等方面效果也比较显著［1－7］．

国外对瓜蒌药材的研究大都围绕在其蛋白凝集素、核糖体灭活蛋白、消炎抗肿瘤活性等方面．有关中药总皂甙抑菌方面的研究在国内已有相关报道，而关于瓜蒌皮总皂甙提取及抗菌方面的研究并未见报道［8－10］．以瓜蒌皮总皂甙提取率为指标，优化其提取工艺，并比较前后抗菌活性效果，以期为拓宽瓜蒌综合加工途径提供技术参考．

1 材料与方法

1．1 材料与试剂

（1）材料．瓜蒌皮（Trichosanthes skin）生药材，由安徽省金寨县惠农瓜蒌专业合作社提供；供试菌种金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），由皖南医学院微生物实验室提供．

（2）试剂．牛肉膏、甲醇（分析纯）、氯化钠（分析纯）、齐墩果酸（分析纯）、香草醛（分析纯）、硫酸、琼脂、蛋白胨（生化试剂）．

1．2 仪器与设备

TD5Z台式低速离心机（上海安亭科学仪器厂）；DFS－200G超声波振荡仪（上海析生超声仪器有限公司）；FC104电子天平（上海精密科学仪器公司）；BS－IEA恒温振荡培养箱（国华电器）；HH－2型恒温水浴锅（金坛市杰瑞尔电器有限公司）；FW100高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；DHG－9143BS电热恒温鼓风干燥箱（上海菁华科技仪器有限公司）．

1．3 方法

（1）瓜蒌皮总皂苷含量测定．准确称取20mg齐墩果酸标准品，用甲醇溶解并定容至25mL容量瓶中，配成0．8mg／mL标准溶液；分别取0．2mL、0．4mL、0．6mL、0．8mL、1．2mL、1．6mL、2．0mL标准溶液于小烧杯中，冰水浴中加入香草醛硫酸溶液5mL（0．05g香草醛溶于浓度65%硫酸中）摇匀，50℃水浴中加热20min，取出后冰水浴中冷却15min，540nm以吸光度（A值）对齐墩果酸浓度绘制标准曲线．取1．0mL瓜蒌皮提取液按照上述方法测定540nm吸光度，根据标准曲线计算皂苷含量及提取率．齐墩果酸标准曲线如图1所示．

（2）瓜蒌皮三萜皂甙提取工艺．瓜蒌皮烘干→粉碎→称重→醇提→离心→取上清液→计算提取率→测活性．

（3）样品预处理及超声辅助提取．将瓜蒌皮置于50～60℃烘箱中烘24h，冷却后粉碎，80目筛，取筛下物留作样品，称取0．5g样品，按料液质量体积比1∶5（g／mL），采用浓度为40%甲醇作为提取溶剂，提取温度30℃、超声波功能75W、超声波提取30min，3 500r／min离心10min，取上清液为粗提物备用．

以1．3（3）样品预处理工艺按表1进行单因素水平实验．以单因素考察试验结果为参考，设计对提取率影响较为明显的甲醇浓度、料液比、超声时间、功率4因素3水平的正交试验L9（34），重复3次，以皂甙提取率为指标．正交试验因素水平如表2所示．

表1　各单因素实验水平设计

表2　正交因素水平表

（4）纸片扩散法测定瓜蒌皮皂苷提取物的体外抑菌活性［11－12］．用小型打孔器在滤纸上打孔，得直径为5mm的圆滤纸片，每张滤纸可以吸收10μL活性提取液，将滤纸片灭菌待用．金黄色葡萄球菌菌苔刮入无菌水后，配制成菌悬液浓度为108CFU／mL的菌悬液．取该菌悬液200μL均匀涂布于无菌牛肉膏蛋白胨固体平板培养基上．用镊子夹取灭过菌的滤纸片，蘸取活性提取物贴于平板表面，培养24h，用游标卡尺测量抑菌圈直径大小，以确定样品抑菌活性．

2 结果与分析

2．1 齐墩果酸标准曲线

以齐墩果酸为标准品，以甲醇为溶剂测定540nm吸光值并绘制标准曲线．标准曲线回归方程为结果显示在质量浓度为0．32～1．28mg／mL范围内，齐墩果酸标准品浓度与吸光度呈线性关系．

2．2 单因素实验及结果

（1）不同浓度甲醇对瓜蒌皮提取物中总皂苷含量的影响如图2所示．由图2可知，随着甲醇浓度的升高，瓜蒌皮提取物中总皂苷含量呈现先增后减趋势．在甲醇浓度为50%时，瓜蒌皮提取物中总皂苷含量达到最大值，说明皂甙可能在不同浓度甲醇中溶解度不一样，50%的甲醇为最佳的提取浓度．

（2）不同料液比对瓜蒌皮提取物中总皂苷含量的影响如图3所示．由图3可知，料液比对提取物中总皂苷含量的影响基本上呈上升趋势．为了减少后续的工艺从而节约试剂，选取料液比1∶15作为最适比．

（3）不同超声波提取时间对瓜蒌皮提取物中总皂苷含量的影响如图4所示．由图4可知，在超声时间为30～50min的区间内皂苷提取率上升，在超声时间为50～70min的区间内皂苷提取率下降．在超声时间为50min时，瓜蒌皮提取物中总皂苷含量达到最大值，因此，选择50min作为瓜蒌皮皂苷的最佳提取时间．

图1　齐墩果酸标准曲线　

图2　不同甲醇浓度对瓜蒌皮提取物中总皂苷含量的影响

图3　不同料液比对瓜蒌皮提取物中总皂苷含量的影响　

图4　不同提取时间对瓜蒌皮提取物中总皂苷含量的影响

（4）不同提取温度对瓜蒌皮提取物中总皂苷含量的影响如图5所示．由图5可知，随超声波提取温度的变化，瓜蒌皮提取物中总皂苷含量无明显变化，这说明瓜蒌皮提取物中总皂苷的溶解度随温度变化不大．

（5）不同超声波功率对瓜蒌皮提取物中总皂苷含量的影响如图6所示．由图6可知，在超声波功率为75～150W的区间内提取物中总皂苷含量上升，在超声波功率为150～175W的区间内下降，在超声波功率为150W时瓜蒌皮提取物中总皂苷含量达到最大值，说明皂甙在其功率下已经基本溶出．随着提取功率的增大，提取率反而降低，这可能是大功能对皂苷物质结构有一定破坏作用．

图5　不同提取温度对瓜蒌皮提取物中总皂苷含量的影响　

图6　不同超声功率对瓜蒌皮提取物中总皂苷含量的影响

2．3 正交实验

正交实验结果如表3所示，方差分析如表4所示．由表4可知，甲醇浓度和超声波时间对瓜蒌皮提取物中总皂苷含量的影响是显著的，其中，甲醇浓度的影响最显著，对瓜蒌皮提取物中总皂苷含量影响最大．影响皂甙提取率因素从大到小的顺序依次为甲醇浓度、超声提取时间、料液比与超声波功率，即A＞C＞B ＝D，最佳提取条件为A2B2C3D2，即甲醇浓度50%、料液比1∶15、超声时间50min、超声功率150W．在最佳条件下，最终瓜蒌皮提取物中总皂苷含量为0．986%，比优化前的0．739%提高了0．247%．

表3　正交实验结果表

表4　方差分析表

2．4 瓜蒌皮总皂苷前后得率及体外抑菌实验比较

用无菌滤纸吸取10μL瓜蒌皮总皂苷提取工艺优化前提取物与优化后提取物进行比对试验，抑菌实验结果如图7所示．由图7可知，瓜蒌皮总皂苷对供试的金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用，且工艺优化后提取物抑菌效果明显好于优化前，抑菌圈分别为10．5mm和15．3mm．瓜蒌皮总皂苷对金黄色葡萄球菌抑制效果随着总皂苷浓度的增大而增大．

图7　抑菌实验结果

3 结论

根据正交试验，超声波辅助提取瓜蒌皮总皂苷最佳提取条件为甲醇浓度为50%、料液比为1∶15、超声时间为50min、超声功率为150W．在该条件下提取率明显提高，达到0．986%．采用纸片扩散法抑菌实验表明，瓜蒌皮总皂苷对金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用，且从抑菌圈直径可以看出瓜蒌皮总皂苷提取工艺优化前后的抑菌效果是有差异的，表明瓜蒌皮总皂苷具有一定抑菌活性．

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Optimization of extraction technology and studying on inhibiting of staphylococcus aureus activity in total saponins from trichosanthes kirilowii maxim peel

LI Wan－zhen，ZHU Long－bao，TAO Yu－gui，QIAN Sen－he
（Engineering Technology Research Center of Anhui Microbial Fermentation，Anhui Polytechnic University，Wuhu 241000，China）

Abstract：In order to optimize the technology for extracting process of total saponins from Trichosanthes kirilowii Maxim peel，on the bases of the single factor experiments for methanol concentration，solid－liquid ratio，extracting time，extracting temperature and Ultrasonic power，the orthogonal experiment L9（34）was designed to optimize the extracting conditions of total saponins．The results showed that the optimal technology for extracting conditions of total saponins were the concentration of methanol 50%，the ratio of solid－liquid of 1∶20，the extracting time of 50min，the Ultrasonic power of 150W．The sequence of extraction process factors is the concentration of methanol＞the extracting＞the ratio of solid －liquid＝the Ultrasonic power．The yield of total saponins increased from 0．739%to 0．986%．Mean while the anti－microbial activity was carried on the extract in vitro，The results showed that the saponins has inhibiting effect on Staphylococcus aureus，with the bacteriostatic ring reaching 15．3mm．

Key words：trichosanthes kirilowii maxim peel；total saponins；ultrasonic－assisted method；antimicrobial activity

基金项目：安徽省自然科学研究基金资助项目（KJ2013B027）

作者简介：李婉珍（1979－），女，安徽六安人，讲师，博士研究生．

收稿日期：2016－01－10

文章编号：1672－2477（2016）01－0005－05

中图分类号：Q946

文献标识码：A